Coleta, incorporação e cultura de gânglios da raiz dorsal em dispositivos multicompartimentais para estudar características neuronais periféricas

Resumo

Este protocolo fornece uma técnica para colher e cultivar gânglio da raiz dorsal (DRG) explantado de ratos Sprague Dawley adultos em um dispositivo multicompartimental (MC).

Resumo

A característica neuronal periférica mais comum da dor é um limiar de estimulação reduzido ou hipersensibilidade dos nervos terminais dos gânglios da raiz dorsal (DRG). Uma causa proposta para essa hipersensibilidade está associada à interação entre células imunes no tecido periférico e neurônios. Os modelos in vitro forneceram conhecimento fundamental para entender como esses mecanismos resultam em hipersensibilidade ao nociceptor. No entanto, os modelos in vitro enfrentam o desafio de traduzir a eficácia para humanos. Para enfrentar esse desafio, um modelo in vitro fisiologicamente e anatomicamente relevante foi desenvolvido para a cultura de gânglios da raiz dorsal intactos (DRGs) em três compartimentos isolados em uma placa de 48 poços. Os DRGs primários são colhidos de ratos Sprague Dawley adultos após a eutanásia humana. O excesso de raízes nervosas é aparado e o DRG é cortado em tamanhos apropriados para cultura. Os DRGs são então cultivados em hidrogéis naturais, permitindo um crescimento robusto em todos os compartimentos. Este sistema multicompartimental oferece isolamento anatomicamente relevante dos corpos celulares DRG de neurites, tipos de células fisiologicamente relevantes e propriedades mecânicas para estudar as interações entre células neurais e imunes. Assim, esta plataforma de cultura fornece uma ferramenta valiosa para investigar estratégias de isolamento de tratamento, levando a uma abordagem de triagem aprimorada para prever a dor.

Introdução

A dor crônica é a principal causa de incapacidade e perda de trabalho em todo o mundo¹. A dor crônica afeta cerca de 20% dos adultos em todo o mundo e impõe um ônus social e econômico significativo², com custos totais estimados entre US$ 560 e US$ 635 bilhões por ano nos Estados Unidos³.

A principal característica periférica exibida por pacientes com dor crônica é um limiar de estimulação dos nervos diminuído, o que leva o sistema nervoso a ser mais responsivo aos estímulos ^4,5. O limiar de estimulação reduzido ....

Protocolo

A colheita do DRG foi realizada em conformidade com o Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais (IACUC) da Universidade de Nebraska-Lincoln. Ratos Sprague Dawley fêmeas com 12 semanas de idade (~ 250 g) foram usados para o estudo. Os detalhes dos animais, reagentes e equipamentos usados no estudo estão listados na Tabela de Materiais.

1. Fabricação e montagem de dispositivos com vários compartimentos

1. Projeto auxiliado por computador e impressão 3D do dispositivo multicompartimento
   NOTA: O dispositivo MC consiste em três compartimentos para o isolamento de corpos celulares DRG e neurites....

Discussão

Este protocolo descreve um método para colher DRGs Sprague Dawley adultos e cultivá-los em hidrogéis naturais 3D. Em contraste com esse método, outras abordagens para a coleta de DRGs de camundongos e ratos envolvem o isolamento da coluna vertebral. A coluna vertebral excisada é reduzida pela metade e a medula espinhal é removida para expor DRGs 23,24,25. Danos à medula espinhal limitam o suprimento sanguíneo, o que afet.......

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
#5 forceps	Fine Science Tools	11252-00	For trimming and cutting DRG
10x DMEM	MilliporeSigma	D2429
1x PBS (autoclaved)	Prepared in lab		7.3 - 7.5 pH
24 well plates	VWR	82050-892	To temporarily store harvested and cut DRGs
3 mL Syringe sterile, single use	BD	309657
48 well plates	Greiner Bio-One	677180
60 mm Petri dish	Fisher Scientific	FB0875713A	To hold media for trimming and cutting
Aluminium foil	Fisherbrand	01-213-104
B27 Plus 50x	ThermoFisher	17504044	For DRG media
Collagen type I	Ibidi	50205
Curved cup Friedman Pearson Rongeur	Fine Science Tools	16221-14	For dissection
Dumont #3 forceps	Fine Science Tools	11293-00	For dissection
Fetal Bovine Serum (FBS)	ThermoFisher	16000044	For DRG media
Form cure	Form Labs		curing agent
Form wash	Form Labs		To wash excess resins off MC
Glass bead sterilizer	Fisher Scientific	NC9531961
Glass vials (8 mL)	DWK Life Sciences (Wheaton)	224724
GlutaMax	ThermoFisher	35050-061	For DRG media
HEPES (1M)	Millipore Sigma	H0887
High temp V2 resin	FormLabs	FLHTAM02
Hyaluronic Acid Sodium Salt	MilliporeSigma	53747	Used to make MAHA
Irgacure	MilliporeSigma	410896
Laminin	R&D Systems	344600501
Large blunt-nose scissors	Militex	EG5-26	For dissection
Large forceps (serrated tips)	Militex	9538797	For dissection
Large sharp-nosed scissors	Fine Science Tools	14010-15	For dissection
Low Retention pipette tips	Fisher Scientific	02-707-017	For pipetting collagen and MAHA
Methacrylated hyaluronic acid (MAHA)	Prepared in lab	N/A	85 - 115 % methacrylation
Nerve Growth Factor (NGF)	R&D Systems	556-NG-100	For DRG media
Neurobasal A Media	ThermoFisher	10888022	For DRG media
Parafilm	Bemis	PM996
Parafilm	Bemis	PM996
Penicillin/Streptomycin (PS)	EMD Millipore	516106	For DRG media
pH test strips	VWR International	BDH35309.606
Pipette tips (1000 µL)	USA Scientific	1111-2021
Preform 3.23.1 software	Formslab		To upload STL file
Rat	Charles River
Resin 3D printer	Form Labs	Form 3L	3D printing MC device
Small sharp-nosed scissors	Fine Science Tools	14094-11	For dissection
Sodium bicarbonate	MilliporeSigma	S6014
Straight cup rongeur	Fine Science Tools	16004-16	For dissection
Straight edge spring scissors	Fine Science Tools	15024-10	For dissection
Surgical Scaplel blade (No. 10)	Fisher Scientific	22-079-690
Syring filters, PES (0.22 µm)	Celltreat	229747
Tiny spring scissors	World Precision Instruments	14003	For trimming and cutting DRG
UV lamp	Analytik Jena US		To photocrosslink hydrogel (15 - 18 mW/cm2)