Modelo de Sustentação de Peso Livre de Tensão da Osteonecrose da Cabeça do Fêmur Induzida por Esteroides em Ratos

Resumo

O protocolo mostra a construção de um modelo de treinamento de sustentação de peso de rato simples e econômico para osteonecrose induzida por esteróides da cabeça femoral usando fita terapêutica elástica.

Resumo

Ao contrário dos humanos, os ratos são animais que andam de quatro, enquanto os humanos são animais bípedes que ficam de pé, e os quadris são submetidos a uma tremenda pressão ao andar e ficar em pé. Em modelos de necrose da cabeça femoral induzida por esteróides em ratos, as características biomecânicas do quadril humano sob pressão mais alta geralmente precisam ser simuladas. Alguns estudiosos tentam imitar o estado de pressão do quadril humano fazendo com que os ratos suportem um certo peso, mas fixar o objeto de sustentação de peso no rato é difícil. Os ratos podem facilmente se libertar da imobilização, e colar o peso nos ratos com fita adesiva fará com que os ratos sufoquem ou morram de obstrução intestinal. Nosso grupo de pesquisa utilizou fita terapêutica elástica para realizar a imobilização sem tensão de objetos de sustentação de peso em ratos, para que os ratos pudessem respirar livremente e não se soltar da imobilização em condições de sustentação de peso. Em comparação com o modelo usual de necrose da cabeça femoral induzida por esteróides em ratos, descobrimos que essa intervenção de sustentação de peso pode agravar a progressão da necrose da cabeça femoral em ratos.

Introdução

A administração de glicocorticóides é o fator de risco mais comum para osteonecrose não traumática da cabeça femoral (ONFH)¹. Inúmeras evidências sugerem que, além dos glicocorticóides, a carga de pressão na articulação do quadril em pacientes também está associada à ocorrência de ONFH. Fatores como peso corporal e intensidade do trabalho físico são reconhecidos como fatores de risco para ONFH². Vários estudos clínicos demonstraram uma estreita relação entre as condições de carga da articulação do quadril e o momento e a incidência da substituição articular 3,4,5,6. Portanto, estabelecer um modelo que reflita a relação entre a carga e a osteonecrose da cabeça femoral induzida por esteróides (SONFH) é importante para uma investigação abrangente dessa condição.

Grandes aves bípedes, como avestruzes e emas, servem como bons modelos para simular o estresse da articulação do quadril, assemelhando-se às cargas das pernas humanas ^7,8. No entanto, manter grandes espécies de aves é um desafio e os custos de pesquisa associados são altos. Modelos de ratos espontaneamente hipertensos ^9,10 podem apresentar taxas mais altas de ONFH, mas a carga de pressão compartimental na medula gerada pela hipertensão espontânea difere significativamente da pressão mecânica e é inadequada para estudar o impacto da pressão mecânica na SONFH.

Modelos de pequenos animais são comumente usados em pesquisas sobre SONFH. No entanto, os répteis quadrúpedes têm menor estresse na articulação do quadril e seus modelos de quadril não podem simular o ambiente biomecânico das articulações do quadril humano durante a caminhada bípede. Os modelos de imobilização de membro único¹¹ e os modelos de descarga parcial¹² são comuns, mas ambos reduzem a carga do membro. Como os humanos são organismos bípedes com cargas substanciais nos membros inferiores em pé e andando, reduzir a carga nesses modelos diminui a conexão entre modelos animais e doenças humanas.

Este estudo tem como objetivo estabelecer um modelo simples e econômico de treinamento com carga para investigar o impacto do treinamento com carga na osteonecrose da cabeça femoral induzida por esteróides em ratos. Atualmente, modelos de ratos têm sido usados para estudar a osteonecrose da cabeça femoral induzida por esteróides^13,14, mas ainda não existe um modelo que possa fornecer fixação segura e de longo prazo com mínima interrupção do movimento, o que também é relativamente simples e barato. Neste estudo, é aplicado um material de fixação altamente adesivo, adotando-se a fixação sem tensão, que mantém a mobilidade dos ratos e reduz o sofrimento e até a morte causados pela fixação inadequada.

Protocolo

O protocolo segue as diretrizes éticas estabelecidas pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais (IACUC) da Universidade de Medicina Chinesa de Pequim, número do protocolo BUCM-4-2022062001-2109. O protocolo utiliza ratos Sprague Dawley (SD) (SCXK(Jing)2019-0008), com idade entre 8 e 10 semanas e pesando 200 g-250 g.

1. Treinamento de adaptação

1. Ratos albinos geralmente têm um alcance visual inferior a 60 cm¹⁵. Durante o processo de modelagem, coloque os ratos em gaiolas opacas e mantenha-os o mais longe possível de ratos não modelados (pelo menos, outros ratos devem estar fora do alcance visual máximo dos ratos modelados) para evitar que sofram estresse traumático.
2. Ligue a energia e ajuste a esteira para 10 m/min com uma inclinação de 0°. Coloque os ratos na esteira e certifique-se de que os movimentos sejam o mais suaves possível para evitar o estresse. Não use estimulação adicional; Os ratos rastejam naturalmente para a frente porque não estão familiarizados com o ambiente.
3. O treinamento dura 15 min. Após o treinamento, limpe as fezes e a urina deixadas pelos ratos e borrife álcool para eliminar o odor do animal. Em seguida, prepare o próximo rato para o treinamento.
   NOTA: Se um rato se recusar a andar na esteira por 5 minutos, exclua-o do estudo.
4. Continue o treinamento adaptativo até o final da^1ª semana.

2. Medição da capacidade máxima de suporte de peso em ratos

1. Prepare dois tubos de ensaio, um gancho e um fecho de laço com aproximadamente 80 cm de comprimento. Coloque esferas de aço nos tubos de ensaio, garantindo que o peso combinado inicial dos tubos de ensaio, do gancho e do fecho de laço seja de 150 g. Prepare tubos de ensaio com diferentes pesos totais em incrementos de 10 g, com o peso máximo sendo de 350 g.
2. Um pesquisador usa as duas mãos para prender ratos usando luvas (Figura 1). Outro pesquisador coloca o tubo de ensaio nas costas do rato a cerca de 1 cm da linha média das costas. Como esta etapa não requer movimento do rato, execute a fixação simplesmente enrolando o fecho de velcro ao redor do rato sem usar medidas adicionais para prender o tubo.
3. Troque o tubo até que o peso máximo do rato seja atingido. Quando o rato atinge o peso máximo, ele não consegue ficar de pé quando cutucado ou o experimentador sai. Reduza o peso em 10 g para permitir que o rato fique de pé. Este peso representa a capacidade máxima de suporte de peso do rato.

3. Preparação da carga de peso

1. Como a fixação segura é necessária durante o treinamento, prenda os objetos usando fita terapêutica elástica de 1-1,5 m com base no tamanho do rato, que tem forte adesão. Use argila para ajustar o peso dos tubos de ensaio para reduzir a oscilação da carga.
2. Depois de pesar o peso dos tubos de ensaio e dos objetos de fixação, adicione uma quantidade adequada de argila nos tubos de ensaio para ajustá-los ao peso desejado. Use uma vareta de vidro para espalhar uniformemente a argila dentro dos tubos de ensaio. A argila concentrada em uma extremidade do tubo de ensaio pode fazer com que ele se solte facilmente durante o treinamento.
3. Ajuste o peso total dos tubos de ensaio e argila ajustados em 50% da capacidade máxima de suporte de peso do rato (Figura 1A). Exceder esse peso tornará difícil para o rato completar o treinamento. Não ajuste o peso da carga novamente até o final do experimento.

4. Estabelecimento da osteonecrose induzida por esteróides do modelo da cabeça femoral

1. Utilizar o método de metilprednisolona combinada com lipopolissacarídeo (LPS+MPS) para o estabelecimento do modelo SONFH^16,17. Realize a injeção intraperitoneal de LPS (20 μg / kg) usando uma agulha padrão na linha média do abdômen do rato uma vez a cada 24 horas, para um total de 2 injeções.
2. Após a última injeção de LPS, injete MPS (40 mg / kg) no músculo glúteo unilateral 24 h após a alimentação regular e continue as injeções a cada 24 h, alternando entre as duas áreas glúteas, para um total de três injeções.

5. Imobilização de sustentação de peso sem tensão usando fita terapêutica elástica e treinamento em esteira

1. Marque a linha média das costas do rato em 1-2 cm em ambos os lados; Este é o ponto de referência para a carga de peso. Certifique-se de que as marcas estejam posicionadas adequadamente para evitar que o rato tombe ou atrapalhe o movimento durante o treinamento na esteira.
2. Com um investigador fixando o rato usando luvas, coloque uma mão sob a axila do rato para prender o membro anterior e a mandíbula, enquanto a outra mão prende os membros posteriores e a cauda. Evite força excessiva para evitar estresse ou asfixia (Figura 1B).
3. Cole a fita terapêutica elástica no tubo de ensaio sem aplicar tensão para prender a carga nas costas do rato. No processo de enrolamento, não estique a fita terapêutica elástica para obter uma fixação sem tensão.
   OBS: A fita terapêutica elástica utilizada neste modelo é projetada para bandagem durante atividades físicas intensas, proporcionando alta aderência e elasticidade¹⁸. Devido à sua alta elasticidade, reduz muito o impacto no movimento do rato enquanto engatinha.
4. Peça ao segundo investigador para fixar o tubo de ensaio nas costas do rato paralelamente à coluna vertebral do rato, com a posição de fixação baseada nas marcações feitas, ou seja, 1-2 cm de distância da linha média em ambos os lados do dorso do rato.
5. Para minimizar o sofrimento do rato, reduzir o impacto no movimento do rato e diminuir a mortalidade causada pela fixação, realize a fixação sem aplicar tensão. Cole o tubo de ensaio com peso ajustado na fita terapêutica elástica e, em seguida, enrole o tubo de ensaio ao redor do corpo do rato usando uma técnica sem tensão.
6. Garanta a imobilização sem tensão e mantenha o comprimento original da fita terapêutica elástica sem esticar para evitar efeitos adversos na respiração e no movimento do rato (Figura 1C).
7. Depois de enrolar o tubo de ensaio ao redor do corpo do rato, coloque-o em um espaço aberto ou em uma única gaiola, monitorando sua respiração e direção. Se aparecerem sinais de respiração rápida ou abertura da boca, solte imediatamente o rato para evitar asfixia.
   1. A imobilização ideal permite que o rato se mova livremente e realize atividades como beber, levantar membros anteriores e se alimentar (Figura 1D). Se a imobilização for insatisfatória, solte temporariamente e imobilize novamente após 20 minutos para minimizar o estresse no rato devido a estímulos de imobilização repetidos.
8. Ligue a energia e ajuste a esteira para 1 m/min com uma inclinação de 0°. O tempo de treinamento em esteira é de 30 min. Transfira suavemente o rato para a esteira e comece o cronômetro.
9. Não forneça estimulação adicional ao rato. Se o rato não conseguir completar o treinamento de 30 minutos, coloque-o em uma gaiola para um descanso de 10 minutos sem remover a fixação.
   NOTA: A fita terapêutica elástica utilizada neste estudo apresenta excelente elasticidade e adesividade. Quando devidamente fixado sem tensão, a fixação a longo prazo não fará com que o tubo de ensaio se solte ou resulte em asfixia e morte do rato.
10. Após o treinamento, limpe as fezes e a urina deixadas pelos ratos e borrife álcool para eliminar o odor do animal.
11. Evite que os passos acima sejam vistos por outros ratos e manuseie os animais com o máximo de cuidado possível para evitar que os animais vocalizem, causando estresse traumático a outros ratos.
12. Solte imediatamente o rato da fixação após completar o treinamento (Figura 1E). Durante a soltura, use os dedos para pressionar o pelo do rato para protegê-lo, minimizando a perda de pelo durante a soltura (Figura 1F).

6. Agrupamento de animais

1. Para estudar o impacto do treinamento de sustentação de peso no SONFH, divida aleatoriamente 60 ratos em quatro grupos.
2. No grupo controle, não estabeleça o modelo comum de osteonecrose induzida por esteróides da cabeça femoral (SONFH) ou realize treinamento de sustentação de peso. No grupo Controle+Carga, realizar apenas o treinamento com carga, sem estabelecer a osteonecrose induzida por esteróides do modelo da cabeça femoral. No grupo Modelo, estabeleça apenas a osteonecrose induzida por esteróides do modelo da cabeça femoral. No grupo Modelo + Carga, realize o treinamento de sustentação de peso após estabelecer a osteonecrose induzida por esteróides do modelo da cabeça femoral.

7. Eutanásia e coleta de espécimes

1. Coloque os ratos em uma câmara de eutanásia de pequenos animais e injete dióxido de carbono suficiente para atingir uma concentração superior a 5%. Uma vez que os ratos percam a consciência, administrar uma dose de 0,3 mL/kg de peso corporal de uma solução de cloreto de potássio a 20%, totalizando 20 mL, por meio de uma injeção intracardíaca.
2. Monitore a respiração e os batimentos cardíacos dos ratos para garantir que eles não sintam dor ou desconforto durante a eutanásia. Confirme a morte verificando a ausência de respiração e batimentos cardíacos. Borrife álcool para limpar qualquer odor.
3. Após a eutanásia, dissecar a região do quadril do rato e extrair a cabeça do fêmur, mantendo o fêmur intacto. Realize uma microtomografia computadorizada após o pré-tratamento, seguida pela coloração de hematoxilina-eosina (HE).

8. Coloração de hematoxilina-eosina

1. Após a conclusão da modelagem, eutanasiar os ratos. Remova os fêmures para coloração HE.
2. Mergulhe os fêmures de ratos em paraformaldeído a 4% por 24 h para preservar os tecidos biológicos como amostras. Mergulhe as amostras de fêmur de rato em ácido fórmico a 5% para descalcificação por 5 dias.
3. Corte as amostras em fatias de 5 μm para coloração HE.
   NOTA: Lacunas vazias referem-se à situação no tecido ósseo¹⁹ onde as lacunas, que normalmente deveriam conter osteócitos, são desprovidas dessas células. É um indicador importante para avaliar a saúde do tecido ósseo. No processo patológico de necrose óssea, o suprimento sanguíneo insuficiente pode causar a morte dos osteócitos, levando a lacunas vazias. No diagnóstico e avaliação da necrose óssea, o número e a distribuição das lacunas vazias são parâmetros importantes para medir a gravidade da^doença20,21.
   1. Coloque amostras femorais de rato em parafina derretida (56-60 °C), primeiro embebendo em parafina de baixo ponto de fusão, se necessário, depois transfira gradualmente para parafina de ponto de fusão mais alto, cada vez por cerca de 1 h, para garantir a infiltração completa do tecido com parafina.
   2. Prepare os moldes de incorporação e despeje a parafina derretida nos moldes até a profundidade apropriada. Recupere as amostras de tecido da parafina usando uma pinça após a imersão, remova o excesso de parafina e coloque-as em moldes. Resfrie à temperatura ambiente para solidificar a parafina, formando blocos de parafina.
   3. Usando um micrótomo de parafina, corte os blocos de parafina embutidos em seções de 5 μm de espessura.
4. Asse as amostras femorais de rato com fatias anexadas em um aquecedor de lâminas por 1 h para aumentar a adesão entre as fatias e a lamínula e reduzir a flutuação durante os processos de coloração subsequentes.
5. Mergulhe as fatias assadas sequencialmente em xileno puro para remover a parafina, seguida de uma série de desidratação através de etanol absoluto, etanol gradiente (100%, 95%, 80%, 70%) e água, por 2 min cada, completando o processo de desparafinização e reidratação.
6. Mergulhe as fatias desparafinizadas em uma solução de coloração de hematoxilina e core por 10 min. Enxágue com água corrente para remover a hematoxilina não ligada.
7. Mergulhe as seções coradas com hematoxilina em solução de coloração de eosina e cove por 2 min para colorir o citoplasma e o tecido conjuntivo. Enxaguado com uma solução de ácido acético a 1% para fixar o efeito de coloração.
8. Mergulhe as fatias de amostra de osso femoral de rato sequencialmente em etanol 70%, 80%, 90%, 95% e 100%, com cada gradiente por 2 min, removendo gradualmente a umidade.
9. Mergulhe as fatias de amostra de osso femoral de rato em xileno puro para transparência, seguido de enxágue com água corrente para remover o xileno. Aplique resina de montagem neutra, cobrindo as corrediças, batendo suavemente para remover bolhas de ar e permitindo que o meio de montagem solidifique para completar o processo de montagem.
10. Usando o pacote randomizr em R, selecione 30 lâminas coradas com HE para cada grupo e aloque 15 lâminas cada para dois pesquisadores. Sem informá-los sobre os agrupamentos, peça aos pesquisadores que calculem a taxa de lacunas vazias das lâminas e coletem os resultados para análise estatística.

9. Análise MicroCT

1. Após a conclusão da modelagem, eutanasiar os ratos. Remova os fêmures para coloração de hematoxilina-eosina.
2. Mergulhe os fêmures de ratos em paraformaldeído a 4% por 24 h para preservar os tecidos biológicos como amostras. Coloque os fêmures de ratos no dispositivo microCT específico para pequenos animais.
3. Defina as condições de varredura microCT da seguinte forma: Tensão de raios-X: 80 kV, Corrente: 100 μA, Tempo de exposição única: 50 ms, Resolução de varredura: 25 μm. Realize varreduras em intervalos de 0,5 °, concentrando-se no osso trabecular de baixo da cartilagem até a parte superior da epífise como a região de interesse.
4. Defina a área acima do colo do fêmur do rato como a região de interesse.
5. Realize a reconstrução do plano coronal dos resultados da varredura usando o dispositivo microCT e colete as medidas morfométricas ósseas geradas pelo software integrado do dispositivo microCT. Registre os seguintes índices observados: Volume Total (VC), Porcentagem de Volume Ósseo (BV/VC), Relação Superfície Óssea/Volume (BS/BV), Espessura da Estrutura (Tb.Th), Separação da Estrutura (Tb.Sp), Número de Osso (Tb.N), Densidade Óssea (DC).

10. Análise estatística

1. Apresente os dados como média ± desvio padrão (DP). Realize análises estatísticas para micro-CT e avaliações histológicas quantitativas usando o teste t de amostra independente. Considere um valor de p < 0,05 como estatisticamente significativo.

Resultados

Análise histopatológica
A coloração de hematoxilina e eosina revelou que no grupo Controle e no grupo Controle + Carga, as trabéculas ósseas estavam intactas e dispostas regularmente. As células endoteliais dos vasos sanguíneos estavam presentes nas covinhas ósseas e a morfologia celular parecia rechonchuda. Em contraste, o grupo Modelo e o grupo Modelo + Carga exibiram trabéculas ósseas fraturadas e desordenadas, juntamente com um número significativament...

Discussão

Atualmente, vários animais, como coelhos²⁵, ratos²⁶, camundongos²⁷, porcos²⁸, frangos²⁹, avestruzes⁸ e emas³⁰ podem ser usados para estabelecer modelos de necrose da cabeça femoral. Entre eles, ratos, camundongos e coelhos são as espécies mais comumente usadas. O rato, como modelo de necrose da cabeça femoral, oferece...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
15ml centrifuge tube	Corning,USA	430791
5mm stainless steel bead	Gelisen,China	5mm
Acetic acid	Merck KGaA, Germany	64-19-7
Anhydrous alcohol	Merck KGaA, Germany	64-17-5
clay	Mincai stationery,China	102
Coverslip	Servicebio,China	WMWD-1818
Flat pressure bottle 10ml	BEHNCKE,China	MD10ml
Formic acid	Macklin Biochemical ,China	64-18-6
HE staining kit	Solarbio,China	G1120
HistoCore AUTOCUT	Leica, Germany	149AUTO00C1
Kinesio tape (elastic therapeutic tape)	Fuluo medicine,China	CL1819
Lipopolysaccharide	Solarbio,China	L8880
Lipopolysaccharides (LPS)	Selleck,USA	S7850
Manual carbon dioxide euthanasia box	Yuyan,China	LC-500-S1
Methylprednisolone sodium succinate,MPS	AbMole,China	M25573
MicroCT	Hiscan,China	Hiscan VM Pro
Neutral resin	Beijing Zhongshan Golden Bridge Biotechnology l ,China	ZLI-9555
Paraffin	Servicebio,China	WGHB-319213129
Paraformaldehyde	Servicebio,China	G1101-500ML
Potassium chloride	Macklin Biochemical ,China	7447-40-7
Slide	Servicebio,China	WG6012
Treadmill for Rats and  mice	Litc Life Science,USA	801
Xylene	Macklin Biochemical ,China	1330-20-7