Imagem de cálcio in vivo de células granulares no giro dentado do hipocampo em camundongos

Resumo

O giro dentado do hipocampo desempenha funções essenciais e distintas na aprendizagem e na memória. Este protocolo descreve um conjunto de procedimentos robustos e eficientes para imagens de cálcio in vivo de células granulares no giro dentado em camundongos em movimento livre.

Resumo

Abordagens em tempo real são normalmente necessárias em estudos de aprendizagem e memória, e a imagem de cálcio in vivo oferece a possibilidade de investigar a atividade neuronal em animais acordados durante tarefas comportamentais. Como o hipocampo está intimamente associado à memória episódica e espacial, tornou-se uma região essencial do cérebro na pesquisa desse campo. Em pesquisas recentes, células de engrama e células de lugar foram estudadas registrando as atividades neurais na região CA1 do hipocampo usando o microscópio em miniatura em camundongos durante a execução de tarefas comportamentais, incluindo campo aberto e trilha linear. Embora o giro dentado seja outra região importante no hipocampo, ele raramente foi estudado com imagens in vivo devido à sua maior profundidade e dificuldade de imagem. Neste protocolo, apresentamos em detalhes um processo de imagem de cálcio, incluindo como injetar o vírus, implantar uma lente GRIN (Gradient-index) e anexar uma placa de base para obter imagens do giro dentado do hipocampo. Descrevemos ainda como pré-processar os dados de imagem de cálcio usando o MATLAB. Além disso, estudos de outras regiões cerebrais profundas que requerem imagens podem se beneficiar desse método.

Introdução

Estudos anteriores descobriram que o hipocampo é uma estrutura cerebral essencial para processar e recuperar memórias^. Desde a década de 1950, os circuitos neurais do hipocampo em roedores têm sido um foco no estudo da formação, armazenamento e recuperação da memória³. As estruturas anatômicas dentro do hipocampo incluem as sub-regiões do giro dentado (DG), CA1, CA2, CA3, CA4 e subículo⁴. Existem conexões bidirecionais complexas entre essas sub-regiões, das quais DG, CA1 e CA3 formam um circuito trissináptico proeminente que consiste em células granulares e células piramidais⁵. Este circuito recebe sua entrada primária do córtex entorrinal (EC) e tem sido um modelo clássico para estudar a plasticidade sináptica. Pesquisas anteriores in vivo sobre a função do hipocampo se concentraram principalmente no CA1 ^6,7 devido ao seu acesso mais fácil. Enquanto os neurônios CA1 desempenham papéis importantes na formação, consolidação e recuperação da memória, particularmente nas células locais para memória espacial, outras sub-regiões do hipocampo também são vitais ^8,9. Em particular, estudos recentes destacaram as funções do DG na formação da memória. As células de lugar no DG foram relatadas como mais estáveis do que as do CA1¹⁰, e suas atividades refletem informações específicas do contexto¹¹. Além disso, a marcação dependente da atividade das células granulares DG pode ser reativada para induzir comportamentos relacionados à memória¹². Portanto, para obter uma compreensão mais profunda da codificação de informações em DG, é crucial investigar as atividades da sub-região DG enquanto o animal está realizando tarefas dependentes de memória.

Estudos prévios sobre as atividades de GD utilizaram principalmente eletrofisiologia in vivo ¹³. No entanto, essa técnica tem algumas desvantagens: primeiro, em gravações elétricas, pode ser difícil identificar diretamente os vários tipos de células que estão gerando o sinal. Os sinais registrados são de células inibitórias e excitatórias. Portanto, outros métodos de processamento de dados são necessários para separar esses dois tipos de células. Além disso, é difícil combinar outras informações de tipo de célula, como subgrupos específicos de projeção ou rotulagem dependente de atividade, com gravações elétricas. Além disso, devido à morfologia anatômica do DG, os eletrodos de registro são frequentemente implantados em uma direção ortogonal, o que limita muito o número de neurônios que podem ser registrados. Assim, é difícil para as gravações elétricas conseguirem monitorar centenas de neurônios individuais da estrutura DG no mesmo animal¹⁴.

Uma técnica complementar de registro das atividades dos neurônios no GD é usar imagens de cálcio in vivo ¹⁵. Os íons de cálcio são fundamentais para os processos de sinalização celular nos organismos, desempenhando um papel crucial em muitas funções fisiológicas, especialmente no sistema nervoso dos mamíferos. Quando os neurônios estão ativos, a concentração de cálcio intracelular aumenta rapidamente, refletindo a natureza dinâmica da atividade neuronal e da transmissão do sinal. Portanto, registrar as mudanças em tempo real nos níveis de cálcio intracelular nos neurônios fornece informações importantes sobre os mecanismos de codificação neural.

A tecnologia de imagem de cálcio utiliza corantes fluorescentes especializados ou indicadores de cálcio geneticamente modificados (GECIs) para monitorar as concentrações de íons de cálcio nos neurônios, detectando mudanças na intensidade da fluorescência, que podem ser capturadas por meio de imagens microscópicas¹⁶. Comumente, a família GCaMP de genes indicadores de cálcio, compreendendo proteínas fluorescentes verdes (GFP), calmodulina e sequências polipeptídicas M13, é empregada. O GCaMP pode emitir fluorescência verde quando se liga a íons de cálcio¹⁷, permitindo que as flutuações na fluorescência verde sejam registradas por meio de imagens¹⁸. Além disso, para obter imagens nítidas da região alvo do cérebro, uma lente de índice gradiente (lente GRIN) é normalmente implantada acima da região de interesse. A lente GRIN permite a aquisição de imagens da região profunda do cérebro que não pode ser acessada diretamente da superfície.

Essa técnica é relativamente fácil de combinar com outras ferramentas genéticas para rotular diferentes tipos de células. Além disso, como o plano de imagem é paralelo à orientação das células no DG, centenas de neurônios são acessíveis para imagens a cada cirurgia bem-sucedida. Neste trabalho, apresentamos um protocolo cirúrgico completo e detalhado para imagens de cálcio in vivo no giro dentado em camundongos (Figura 1). O procedimento envolve duas operações principais. A primeira é injetar o vírus AAV-CaMKIIα-GCaMP6f no DG. A segunda operação é implantar uma lente GRIN acima do local da injeção do vírus. Estes dois procedimentos são conduzidos na mesma sessão. Após a recuperação dessas cirurgias, o próximo passo é verificar a qualidade da imagem com microscópios miniaturizados (miniscópios). Se o campo de imagem tiver centenas de células ativas, o procedimento subsequente é anexar a placa de base do miniscópio ao crânio do camundongo usando cimento dentário; O mouse pode então ser usado para experimentos de imagem. Também apresentamos um pipeline de pré-processamento baseado em MATLAB para agilizar a análise dos dados de cálcio coletados.

Protocolo

Todos os procedimentos com animais foram aprovados pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais da Universidade de Fudan (202109004S). Todos os animais utilizados neste estudo eram C57BL/6J de 6 meses de idade; ambos os sexos foram usados. Os camundongos foram mantidos em um ciclo de luz de 12 horas, das 8h às 20h. Foram utilizadas as seguintes coordenadas para injeção de vírus em DG: A/P: -2,2 mm, M/L: 1,5 mm, D/V: 1,7 mm da superfície cerebral.

1. Injeção de vírus no giro dentado

1. Use equipamento de proteção, incluindo luvas e aventais estéreis de uso único.
2. Prepare os instrumentos cirúrgicos necessários, dois tubos de 5 mL de solução salina (NaCl 0,9% [estéril] ou líquido cefalorraquidiano artificial) e duas agulhas rombas luer lock 25 G.
   NOTA: Todos os instrumentos cirúrgicos devem ser completamente esterilizados antes da operação. Utilizamos autoclavagem em alta temperatura (121-134 °C) e pressão (20 psi) para esterilizar os instrumentos cirúrgicos. Além disso, pulverizamos as superfícies com desinfetantes à base de álcool. Em todos os procedimentos cirúrgicos, utilizamos solução salina estéril a 0,9%. Os instrumentos foram esterilizados intermitentemente durante a cirurgia com esferas de vidro aquecidas.
3. Prepare uma solução de água sanitária a 10% em água para desinfetar quaisquer suprimentos que possam entrar em contato com o vírus.
4. Diluir o vírus AAV-CaMKIIα-GCaMP6f, se necessário, utilizando soro fisiológico esterilizado, e conservá-lo no frigorífico a 4 °C ou no gelo. O título final alvo do vírus é 1 × 10¹² GC/mL.
   NOTA: Recomendamos evitar ciclos repetidos de congelamento e descongelamento do vírus para preservar a integridade do vírus. Para esse fim, geralmente alíquotas do vírus quando recebido do fabricante em pequenos volumes (por exemplo, 2 μL por tubo) e os mantemos em um freezer a -80 °C. O vírus deve ser utilizado no dia da descongelação e não deve ser armazenado a 4 °C para utilização a longo prazo.
5. Use um extrator de micropipeta para puxar a micropipeta para uma ponta fina, corte uma pequena parte da ponta com uma tesoura cirúrgica e encha o tubo com óleo mineral. Certifique-se de que a pipeta possa sugar o líquido normalmente e, em seguida, instale-a no injetor.
   NOTA: Usamos um método de tração de uma etapa com o aquecedor ajustado em ~ 60% da potência máxima. Outros extratores podem ser usados para esta etapa. O objetivo geral é fazer a ponta ~ 50-100 μm de diâmetro; um diâmetro muito pequeno afetará o fluxo do líquido; muito grosso pode causar danos ao tecido cerebral do camundongo.
6. Ligue todos os instrumentos, incluindo a máquina de anestesia com mouse, máquina de manutenção de temperatura (almofada de aquecimento) e bomba de vácuo. Além disso, meça o peso corporal dos camundongos antes da cirurgia.
   NOTA: Durante o procedimento, monitoramos visualmente a respiração do camundongo e ocasionalmente verificamos a temperatura corporal para garantir que eles estivessem em boas condições.
7. Coloque o mouse na câmara de gás com 2,5% de isoflurano e 1 L de oxigênio/min. Monitore as condições respiratórias do mouse para avaliar o estado da anestesia.
   NOTA: A frequência respiratória deve ser de cerca de 1 respiração/s para manter o mouse em boa saúde.
8. Retire o mouse da câmara de gás e coloque-o no aparelho estereotáxico.
9. Certifique-se de que o mouse esteja adequadamente anestesiado antes de iniciar a próxima operação. Teste o reflexo de retirada do pedal apertando as almofadas dos pés de ambas as patas traseiras. Se o mouse responder ao beliscão da almofada do pé, administre anestesia adicional e teste novamente o reflexo antes de prosseguir.
10. Cubra o nariz do rato com uma máscara e defina a taxa de fluxo de isoflurano para 1,5%. Fixe a cabeça do mouse firmemente com as barras auriculares (Figura 2A).
    NOTA: Tenha cuidado para não fixar as barras auriculares com muita força no mouse, pois isso pode afetar facilmente a respiração do mouse e, em alguns casos, causar a morte.
11. Apare o topo da cabeça do rato com uma tesoura cirúrgica e use creme depilatório para remover qualquer resíduo de cabelo até que a pele esteja completamente exposta. Aplique o creme depilatório no couro cabeludo do camundongo, deixe descansar por aproximadamente 5 min e use gaze para limpar o creme.
12. Aplique pomada oftálmica nos olhos do rato.
13. Desinfete a área sem pelos com desinfetante iodóforo e etanol 75% usando cotonetes.
14. Faça uma incisão contínua ao longo da linha média do couro cabeludo usando uma tesoura cirúrgica (ou uma lâmina de bisturi) e corte parte do couro cabeludo para expor a superfície do crânio (Figura 2B). Enxágue a superfície do crânio com solução salina; Em seguida, remova a fáscia e o excesso de solução salina usando uma bomba de vácuo. Repita esse processo várias vezes até que a área ao redor da ferida pare de sangrar. Limpe a superfície do crânio com cotonetes para mantê-lo seco.
    NOTA: Existem outras maneiras de remover a fáscia, como limpá-la com uma bola de algodão ou cotonete.
15. Use a agulha de localização para ajustar a superfície craniana quando o bregma e o lambda estiverem visíveis. Faça vários ajustes até que toda a cabeça esteja nivelada (o erro total na direção do eixo Z é inferior a 0,05 mm).
16. Mova a ponta da agulha do bregma para a posição alvo apropriada. Para as coordenadas de destino, use o bregma como ponto de referência. Marque os quatro pontos para definir o perímetro do local de injeção do vírus: A/P: -2,0 mm, M/L: -1,5 mm; A/P: -2,5 mm, M/L: -1,5 mm; A/P -2,25 mm, M/L: -1,0 mm; e A/P -2,25 mm, M/L: -2,0 mm, com marcador apagável.
    NOTA: Este protocolo realiza a injeção do vírus e o implante da lente GRIN na mesma cirurgia. Neste protocolo, todas as cirurgias foram realizadas no hemisfério direito, mas é concebível que qualquer um dos hemisférios possa ser usado. Dentro da área de injeção definida pelos quatro pontos mencionados acima, injetar o vírus em três doses separadas de 80 nL em locais diferentes. Embora os três locais tenham sido escolhidos arbitrariamente, recomendamos que sejam dispersos para melhor propagação do vírus. Isso aumentará o número de células infectadas.
17. Faça a craniotomia na região com a microbroca e defina esses quatro pontos como borda. Pare de perfurar quando o tecido cerebral estiver visível (Figura 2C).
    NOTA: Tente perfurar o crânio lentamente. A broca pode danificar o tecido cerebral devido à força excessiva. A perfuração lenta também pode evitar o superaquecimento do cérebro.
18. Remova os detritos ósseos e a dura-máter usando uma pinça ultrafina e enxágue constantemente essa área com solução salina estéril.
    NOTA: É normal que ocorra uma pequena quantidade de sangramento durante esta etapa, pois alguns capilares se rompem; Continue enxaguando com soro fisiológico até que não haja mais sangramento.
19. Use o painel de controle do injetor para ejetar um pouco de óleo mineral para gerar o espaço necessário para o carregamento subsequente do vírus. Encha a micropipeta com pelo menos 240 nL do vírus diluído a uma velocidade de 100 nL / s.
    NOTA: As bolhas de ar no tubo devem ser descarregadas usando o painel de controle para garantir que a micropipeta dispense a quantidade adequada de líquido. Se o volume de líquido ainda estiver impreciso após várias tentativas, considere trocar a micropipeta e começar de novo. Recomendamos aspirar algum vírus adicional ao volume real de injeção; Essa abordagem evita a injeção inadvertida de óleo mineral no cérebro do camundongo.
20. Mova a micropipeta acima da região da craniotomia; em seguida, mova-o lentamente para baixo no tecido cerebral até o eixo Z alvo de D / V: 1,70 mm abaixo da superfície do cérebro.
    NOTA: Muitos atlas de referências usam a superfície do crânio como D / V 0. Em nossa experiência, o uso das coordenadas da superfície do cérebro produziu um direcionamento mais confiável para DG.
21. Use o painel de controle para configurar o injetor para injetar 80 nL do vírus a uma taxa de fluxo de 1 nL/s (Figura 2D). Clique no botão INJETAR no painel de controle para injetar o vírus. Em seguida, selecione duas outras posições dentro da craniotomia e repita a operação anterior.
    NOTA: Cada injeção leva ~ 2 min. Depois de terminar a injeção, aguarde mais 8 a 10 minutos antes de passar para outra posição. Quando ocorrer sangramento durante a remoção, lave imediatamente com solução salina.
22. Remova a micropipeta do cérebro lentamente (Figura 2E).

2. Implante de lente GRIN no giro dentado

NOTA: Execute esta etapa imediatamente após concluir a injeção viral de 240 nL.

1. Desinfetar a lente GRIN de 1 mm de diâmetro em etanol a 75% por 20 min; Enxágue adequadamente com solução salina antes da implantação.
2. Expanda a craniotomia usando a microbroca para aumentar a abertura na direção A/P para aproximadamente 1 mm. Limpe os detritos com solução salina.
3. Prenda a lente GRIN no lugar com um suporte e certifique-se de expor um comprimento adequado.
   NOTA: É fácil colar o suporte na lente GRIN ao fixá-lo no crânio usando resina UV nas etapas subsequentes. No entanto, isso pode ser evitado se o comprimento exposto da lente for adequado.
4. Use o suporte para mover a lente GRIN acima da região da craniotomia. Defina a posição do eixo Z como zero quando a parte inferior da lente GRIN tocar a superfície do tecido cerebral. Em seguida, remova o suporte da lente GRIN e coloque-o de lado.
5. Conecte a agulha romba de trava luer 25 G ao tubo de sucção da bomba de vácuo e ajuste a pressão para 0.04 MPa.
   NOTA: Se esta etapa for realizada pela primeira vez, a pressão pode ser reduzida adequadamente para aspirar lentamente o tecido cerebral.
6. Sugue o tecido cerebral girando a ponta da agulha romba bem acima do tecido cerebral e pressione suavemente o tecido cerebral para facilitar a aspiração. Enxágue com solução salina (armazene a 4 ° C) continuamente durante a sucção para manter uma visão clara do cérebro. Observe as características do tecido de perto para monitorar a profundidade da aspiração: o tecido cortical é rosa pálido, o corpo caloso abaixo aparece como tecido branco e fibroso e a camada CA1 do hipocampo é vermelha escura e cinza. Pare a sucção quando a superfície do tecido ficar lisa e uma grande área de CA1 for exposta (Figura 3).
   NOTA: Esta etapa é fundamental para o sucesso de todo o procedimento e geralmente é a parte mais difícil. Fornecemos uma lista de problemas comuns para ajudar os leitores a solucionar essa etapa (Tabela 1). Além disso, recomendamos enxaguar a ferida continuamente com soro fisiológico frio, pois isso pode reduzir o sangramento até certo ponto.
   1. Se a agulha ficar entupida; Prenda a agulha bloqueada a uma seringa e lave o bloqueio. Tente trocar a agulha se isso não funcionar.
   2. Se o sangramento for constante, pode bloquear a visão do tecido cerebral. Se isso acontecer, espere o sangue coagular e enxágue com soro fisiológico.
7. Mova o suporte acima do orifício perfurado. Defina o eixo Z para 0 quando a lente GRIN entrar em contato com a superfície do tecido cerebral. Se a lente GRIN exceder o diâmetro do furo, use a microbroca para expandir o furo. Em seguida, repita este procedimento.
8. Insira a lente GRIN no orifício em D/V: -1.32 mm. Deixe o suporte repousar por 5-10 min. Depois de levantar o suporte, enxágue o orifício com solução salina. Repita esta etapa 3x (Figura 4A).
   NOTA: É normal que o tecido cerebral sangre durante esta etapa. Após repetidas lavagens com solução salina, não deve haver mais sangue no buraco. A qualidade da imagem é muito afetada por esta etapa e, se o sangue não for limpo, pode fazer com que o campo de imagem fique preto.
9. Use solução salina para limpar bem o crânio e depois deixe o crânio secar antes de aplicar a resina UV.
10. Use uma agulha para aplicar a resina UV ao redor da lente GRIN. Ilumine esta área com uma luz UV por 15 s e certifique-se de que a resina UV se torne sólida (Figura 4B).
    NOTA: Aplique a resina UV um pouco de cada vez e repita esta operação várias vezes até que a área ao redor da lente GRIN esteja coberta. Tenha cuidado para não fixar a lente GRIN no suporte ao usar a luz UV para iluminação.
11. Remova o suporte da lente GRIN com cuidado. Cubra todo o crânio exposto com resina UV e coloque a placa de cabeça no crânio na posição apropriada. Ilumine todo o crânio e a placa da cabeça com uma luz ultravioleta por 15 s (Figura 4C).
    NOTA: A placa de direção é um componente para manter a cabeça do mouse no lugar ao conectar a placa de base (consulte o Arquivo Suplementar 1 para obter o design). Prenda a placa de cabeça o mais firmemente possível; Uma placa de cabeça destacada resultará na falha de toda a cirurgia. Em nossa experiência, a aplicação completa da resina UV deve ser capaz de fornecer uma fixação firme. Se for necessária uma fixação mais forte, pode-se considerar a instalação de parafusos de caveira.
12. Cubra a lente GRIN exposta com uma tampa protetora impressa em 3D (consulte o Arquivo Suplementar 2 para o design). Fixe a tampa na placa de cabeça usando parafusos M1.6 (Figura 4D).
13. Injete dexametasona por via intraperitoneal (dissolvida em solução salina a 0,9%, 2 mg / kg) após a operação para prevenir a inflamação pós-operatória. Além disso, administre injeções subcutâneas de carprofeno (dissolvido em solução salina a 0,9%, 5 mg / kg) para reduzir a dor pós-operatória.
14. Coloque os ratos de volta na gaiola e transfira-os para um cobertor térmico para facilitar sua recuperação. Em seguida, transfira os ratos para o biotério experimental depois que eles puderem se mover livremente.
    NOTA: Para evitar danos à placa de base por luta, os camundongos que foram submetidos à cirurgia podem ser alojados individualmente ou com um número mínimo de coabitantes. Recomendamos não exceder três camundongos em uma gaiola após a cirurgia.
15. Desinfete as superfícies de trabalho usando uma solução de alvejante a 10%. Remova o equipamento de proteção individual (EPI) descartável e descarte-o em sacos de risco biológico.
16. Monitore os camundongos diariamente por 3 dias após a cirurgia. Registre o peso corporal dos ratos e observe seu status de cicatrização de feridas e atividades de locomoção. Forneça injeções intraperitoneais diárias de soluções de dexametasona e carprofeno (a mesma dosagem da etapa 2.13) por 3 dias. Forneça ração úmida ou tratamento para facilitar a recuperação quando necessário.

3. Verifique a qualidade do campo de imagem

NOTA: O camundongo se recupera em 2-3 semanas após a cirurgia antes da primeira sessão de imagem de cálcio in vivo . O objetivo desta etapa é verificar a qualidade da cirurgia e a recuperação do camundongo. Se a atividade de uma única célula puder ser observada no campo de imagem e o camundongo estiver em boas condições, fixe a placa de base no crânio do camundongo. O camundongo deve ser sacrificado por luxação cervical se a qualidade da imagem ou a condição de saúde não forem adequadas.

1. Conecte a caixa de coleta de dados do miniscope ao computador com um cabo USB 3.0. Em seguida, conecte o cabo coaxial à caixa por meio do conector To Scope (SMA).
2. Ligue o software de controle miniscope. No Software, clique em Selecionar arquivo de configuração | Arquivos de configuração do usuário V4 plus para visualizar as imagens ao vivo.
3. Use um suporte personalizado para manter o mouse no volante de corrida clamp a placa de cabeça. Segure o miniscópio com o suporte do miniscópio (feito com impressão 3D; consulte o Arquivo Suplementar 3 para design) e utilize um instrumento estereotáxico para mover o miniscópio acima da cabeça do mouse (Figura 4E).
4. Remova a tampa com uma chave de fenda. Limpe suavemente a superfície da lente GRIN com etanol 75%. Posicione o miniscópio logo acima da lente GRIN exposta e torne a superfície inferior do osciloscópio paralela à superfície da lente. Encontre o melhor plano focal trazendo lentamente o miniscópio para baixo em direção à lente GRIN.
   NOTA: Defina o plano focal em 0 e ajuste a posição do miniscópio; Isso fornece mais espaço para ajustar o foco. Selecione o plano focal com uma visualização clara do maior número de células.
5. No software de controle do miniscópio, ajuste a potência da luz LED para o nível ideal.
   NOTA: Para observar a atividade de uma única célula, o campo de imagem não deve estar superexposto nem muito escuro. A intensidade do LED é normalmente de 10%.
6. Se o fluxo sanguíneo vascular for visível e as células forem numerosas e uniformemente distribuídas por todo o campo de imagem, prossiga para a próxima seção do experimento.
   NOTA: Nesta etapa, é importante ser capaz de observar a atividade de uma única célula. Isso pode influenciar os resultados da análise dos dados. Normalmente, as atividades regionais (bolhas de flutuações fluorescentes) são difíceis de interpretar. Isso pode ser uma indicação de que os neurônios-alvo estão fora de foco da lente GRIN. O camundongo não será usado nos experimentos subsequentes se parecer que o campo de imagem é preto, as células exibem atividade regional ou há um número insuficiente de células.
7. Desconecte o cabo do miniscópio.

4. Anexe a placa de base do miniscópio ao crânio do rato

1. Fixe a placa de base ao miniscópio e reajuste as posições do miniscópio para obter um campo de visão com boa qualidade de imagem.
2. Misture os materiais da base da prótese no copo de mistura.
   NOTA: É importante que a mistura não flua muito livremente nem seja muito firme. Muita fluidez tende a cobrir a superfície da lente GRIN, causando a perda do campo de imagem. Se muito firmes, os materiais de base da prótese não serão capazes de cobrir firmemente o espaço entre a placa de base e a placa de cabeça.
3. Tome cuidado para não alterar a posição do miniscópio ao aplicar cuidadosamente a primeira camada de materiais de base da prótese ao redor da placa de base do miniscópio. Aguarde a primeira camada de cimento endurecer antes de aplicar uma segunda camada de cimento da placa de base até a placa de cabeçote. Após o endurecimento de todos os materiais de base da prótese, afrouxe o parafuso de fixação e solte o miniscópio da placa de base.
   NOTA: Ao usar materiais de base de prótese, preste atenção ao campo de imagem no software e faça os ajustes necessários antes que o cimento solidifique.
4. Remova o braço de retenção do miniscópio com cuidado.
5. Coloque a tampa da placa de base na placa de base para proteger a lente GRIN exposta e aperte o parafuso de fixação (Figura 4F).
6. Coloque o mouse de volta em sua gaiola inicial. Dê ao rato vários dias para se recuperar antes de realizar os experimentos comportamentais.

5. Aquisição de dados

NOTA: A imagem de cálcio in vivo pode ser realizada simultaneamente com qualquer teste de comportamento. Neste protocolo, usamos a pista linear como exemplo. Esta pista linear tem 1,5 m e tem água em ambas as extremidades, o que serve de recompensa para os ratos. Os ratos podem usar um microscópio em miniatura (miniscópio) e correr para frente e para trás ao longo da pista por um período de 20 minutos. Durante esse tempo, os camundongos normalmente são capazes de executar ~ 60 tentativas.

1. Conecte a caixa de coleta de dados do miniscope ao computador com um cabo USB 3.0. Em seguida, conecte o cabo coaxial à caixa por meio do conector To Scope (SMA).
2. Ligue o software de controle miniscope. No software de controle miniscope, clique em Selecionar arquivo de configuração | Arquivos de configuração do usuário V4 plus para visualizar as imagens ao vivo.
3. Conecte a câmera industrial ao computador com um cabo USB 3.0.
4. Ligue o software de controle da câmera. No software, clique em Abrir equipamento e selecione o arquivo para importar os parâmetros de coleta de dados. Selecione o formato de vídeo como Vídeo descompactado no contêiner AVI. Clique no botão Iniciar para visualizar as imagens ao vivo.
   NOTA: Para diminuir o tamanho do arquivo do vídeo de gravação comportamental, o campo de view deve excluir quaisquer áreas desnecessárias fora da faixa.
5. Use um suporte personalizado para manter o mouse no volante de corrida clamp a placa de cabeça.
6. Afrouxe o parafuso de fixação com uma chave de fenda, remova a tampa da placa de base e limpe a superfície da lente GRIN com etanol a 75%.
7. Monte o miniscópio em sua base. Prenda o miniscópio em sua base na cabeça do mouse.
8. Encontre o melhor plano focal deslizando o botão do plano focal.
9. Mova o mouse da roda de corrida para a pista linear suavemente.
10. Clique e segure o botão Gravar para começar a gravar com o miniscópio. Em seguida, clique no botão Iniciar coleta para iniciar a gravação da câmera. Grave por 20 min.
11. Salve dados de imagem de cálcio in vivo , dados comportamentais e dados do Arduino separadamente. Nomeie esses arquivos com data, número da sessão e número do mouse.
    NOTA: Os estudos que usam um miniscópio tendem a ter um período de coleta de dados de longo prazo em um único animal experimental. Nomear os arquivos claramente pode ajudar no procedimento de processamento de dados.
12. Desconecte o miniscópio de sua base.
13. Feche o software de controle da câmera, o software de controle do miniscópio e o computador.
14. Desconecte o cabo coaxial do To Scope (SMA) e o cabo USB 3.0 da câmera.
15. Desaperte o parafuso de fixação na base, coloque a tampa da placa de base de volta e aperte o parafuso.
16. Coloque o mouse de volta em sua gaiola inicial.

6. Processamento de dados

1. Carregue os dados de imagem de cálcio registrados no MATLAB.
   NOTA: Reconhecemos que a análise dos dados deve ser adaptada ao desenho experimental. Aqui, fornecemos um pipeline de pré-processamento que converte o vídeo de imagem de cálcio bruto em traços de atividade de células individuais. Acreditamos que este procedimento é relativamente universal e útil para os usuários. Todos os scripts descritos nesta seção podem ser encontrados no Arquivo Suplementar 4.
2. Converta os dados de imagem do formato AVI para HDF5 (.h5).
   NOTA: A saída bruta do miniscópio gera arquivos AVI com compactação. Os arquivos descompactados geralmente têm dezenas de gigabytes de tamanho. O formato de arquivo HDF5 permite acesso virtual e parcial que pode ser facilmente visualizado e manipulado para análise posterior.
3. Aplique a correção de movimento não rígida (NoRMCorre)¹⁹.
4. Reduza a amostra do filme corrigido por movimento caso o computador tenha RAM limitada para etapas posteriores.
   NOTA: Os dados originais coletados pelo miniscope têm um tamanho de 600 x 600. Usando uma amostra espacial, podemos reduzir o tamanho do vídeo para 200 x 200. Este método diminui significativamente os requisitos de armazenamento de dados e permite um processamento de dados mais rápido.
5. Aplique EXTRACT nos dados com amostragem reduzida para identificar sinais de célula única, seguindo as instruções para o código EXTRACT no repositório online²⁰ (https://github.com/schnitzer-lab/EXTRACT-public).

Resultados

A Figura 1 mostra o esquema do procedimento experimental, incluindo injeção de vírus, implante de lente GRIN, fixação da placa de base, imagem de cálcio in vivo por meio de um miniscópio e processamento de dados. Geralmente, todo o procedimento leva 1 mês. A Figura 2 mostra exemplos de procedimentos de injeção de vírus, incluindo o posicionamento do orifício perfurado no crânio e a condição do tecido cerebral antes do implante da lente GR...

Discussão

Aqui descrevemos um procedimento para imagem de cálcio in vivo no GD de camundongos. Acreditamos que este protocolo será útil para pesquisadores que pretendem estudar as funções do DG em vários processos cognitivos, particularmente nos casos em que uma subpopulação geneticamente identificada é de interesse. Aqui explicamos as vantagens do nosso protocolo, enfatizando alguns pontos-chave na cirurgia, e discutimos as limitações desse método.

Testamos vários procedimentos pa...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
200 μL universal pipette tips	Transcat Pipettes	1030-260-000-9	For removing the blood and saline
25 G luer lock blunt needle (Prebent dispensing tips)	iSmile	20-0105	For removing the brain tissue
3D printed protective cap	N/A	N/A	To protect the GRIN Lens
75% ethanol	Shanghai Hushi Laboratory Equipment Co.,Ltd	bwsj-230219105303	For disinfection and cleaning the GRIN lens surface
AAV2/9-CaMKIIα-GCaMP6f virus	Brain Case	BC-0083	For viral injection
Adobe Illustrator	Adobe	cc 2018 version 22.1	To draw figures
Anesthesia air pump	RWD Life Science Co.,Ltd	R510-30	For anesthesia
Camera control software	Daheng Imaging	Galaxy Windows SDK_CN (V2)	For recording the behavioral data
Cannula/Ceramic Ferrule Holders (GRIN lens holder)	RWD Life Science Co.,Ltd	68214	To hold the GRIN lens
Carprofen	MedChemExpress	53716-49-7	To reduce postoperative pain of the mouse
Coax Cable	Open ephys	CW8251	To connect the miniscope and the miniscope DAQ box
Confocal microscope	Olympus Life Science	FV3000	For observing the brain slices
Cotton swab	Nanchang Xiangyi Medical Devices Co.,Ltd	20202140438	For disinfection
Customized headplate	N/A	N/A	For holding the mouse on the running wheel
Customized headplate holder	N/A	N/A	To hold the headplate of the mouse
Denture base matierlals (self-curing)	New Centry Dental	430205	For attaching the miniscope
Depilatory cream	Veet	ASIN : B001DUUPQ0	For removing the hair of the mouse
Desktop digital stereotaxic in strument, SGL M	RWD Life Science Co.,Ltd	68803	For viral injection and GRIN lens implantation
Dexamethasone	Huachu Co., Ltd.	N/A	To prevent postoperative inflammation of the mouse
Dissecting microscope	RWD Life Science Co., Ltd	MZ62-WX	For observing the conditions during surgeries
Gas filter canister, large, packge of 6	RWD Life Science Co.,Ltd	R510-31-6	For anesthesia
GRIN lens	GoFoton	CLHS100GFT003	For GRIN lens implantation
GRIN lens	InFocus Grin Corp	SIH-100-043-550-0D0-NC	For GRIN lens implantation
Induction chamber-mouse (15 cm x 10 cm x 10 cm)	RWD Life Science Co.,Ltd	V100	For anesthesia
Industrial camera	Daheng Imaging	MER-231-41U3M-L, VS-0618H1	For acquiring the behavioral data
Iodophor disinfectant	Qingdao Hainuo Innovi Disinfection Technology Co.,Ltd	8861F6DFC92A	For disinfection
Isoflurane	RWD Life Science Co.,Ltd	R510-22-10	For anesthesia
Liquid sample collection tube (Glass Capillaries micropipette for Nanoject III)	Drummond Scientific Company	3-000-203-G/X	For viral injection
MATLAB	MathWorks	R2021b	For analyzing the data
Microdrill	RWD Life Science Co.,Ltd	78001	For craniotomy
Micropipette puller	Narishige International USA	PC-100	For pulling the liquid sample collection tube
Mineral oil	Sigma-Aldrich	M8410	For viral injection
Miniscope DAQ Software	Github (Aharoni-Lab/Miniscope-DAQ-QT-Software)	N/A	For recording the calcium imaging data
Miniscope Data Acquisition (DAQ) Box (V3.3)	Open ephys	V3.3	To acquire the calcium imaging data
Miniscope V4	Open ephys	V4	For in vivo calcium imaging
Miniscope V4 base plate (Variant 2)	Open ephys	Variant 2	For holding the miniscope
nanoject III Programmable Nanoliter Injector	Drummond Scientific Company	3-000-207	For viral injection
Ophthalmic ointment	Cisen Pharmaceutical Co.,Ltd.	H37022025	To keep the eyes moist
PCR tube	LabServ	309101009	For dilue the virus
Personal Computer (ThinkPad)	Lenovo	20W0-005UCD	To record the calcium imaging data and behavioral data
Running wheel	Shanghai Edai Pet Products Co.,Ltd	NA-H115	For holding the mouse when affixing the base plate
Screwdriver (M1.6 screws)	Greenery (Yantai Greenery Tools Co.,Ltd)	60902	To unscrew the M1.6 screws
Screwdriver (set screws)	Greenery (Yantai Greenery Tools Co.,Ltd)	S2	For unscrew the set screws
Set screw	TBD	2-56 cone point set screw	For fasten the miniscope to its base plate
Small animal anesthesia machine	RWD Life Science Co.,Ltd	R500	For anesthesia
Sterile syringe	Jiangsu Great Wall Medical Equipment Co., LTD	20163140236	For rinse the blood
Surgical scissors	RWD Life Science Co.,Ltd	S14016-13	For cutting off the hair and scalp
ThermoStar temperature controller,69025 pad incl.	RWD Life Science Co.,Ltd	69027	To maintain the animal's body temperature
Ultra fine forceps	RWD Life Science Co.,Ltd	F11020-11	For removing the bone debris and dura
USB 3.0 cable	Open ephys	N/A	To connect the miniscope DAQ box and the computer
UV light	Jinshida	66105854002	To fix the GRIN lens on the skull
UV resin (light cure adhesive)	Loctite	32268	To fix the GRIN lens on the skull
Vacuum pump	Kylin-Bell	GL-802B	To remove the blood, saline and the brain tissue