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Neste Artigo

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  • Reimpressões e Permissões

Resumo

O presente protocolo descreve o uso da tecnologia de código de barras de DNA para autenticar materiais medicinais à base de plantas, e a planta medicinal Angelica sinensis (Oliv.) Diels foi identificado como um exemplo.

Resumo

As plantas medicinais são recursos valiosos em todo o mundo e são usadas em todo o mundo para manter a saúde e tratar doenças; no entanto, a presença de adulteração obstrui seu desenvolvimento. O código de barras de DNA, uma técnica para identificação de espécies por regiões de DNA padrão, facilita a identificação rápida e precisa de plantas medicinais tradicionais. O processo de código de barras de DNA envolve seis etapas básicas: 1) processamento das plantas medicinais, 2) extração de DNA total de alta qualidade das plantas medicinais usando o método da coluna centrífuga, 3) amplificação do espaçador transcrito interno da região do DNA alvo 2 (ITS2) com primers universais de plantas e realização do sequenciamento de Sanger, 4) emenda e alinhamento da sequência para obter a sequência alvo, 5) combinar a sequência do código de barras com a biblioteca de códigos de barras para identificação, 6) alinhar a sequência, comparando a variação intraespecífica e interespecífica, construindo a árvore filogenética de junção de vizinhos. Conforme mostrado nos resultados, o primer universal pode amplificar a região-alvo. A Basic Local Alignment Search Tool (BLAST) demonstra que a porcentagem identificada foi de 100%, e a árvore de junção de vizinhos demonstra que as sequências de splicing foram agrupadas com o clado A. sinensis OR879715.1 e o valor de suporte do clado é 100. Este protocolo fornece uma referência para a aplicação da tecnologia de código de barras de DNA como um método eficaz para identificar plantas medicinais e adulterantes.

Introdução

As plantas medicinais têm uma ampla gama de efeitos farmacológicos e são substâncias importantes para o tratamento e prevenção de doenças. A demanda do mercado por plantas medicinais em medicamentos fitoterápicos e produtos farmacêuticos é enorme e ainda está crescendo. Com o aumento do mercado de plantas medicinais, o problema da adulteração tem dificultado o desenvolvimento de plantas medicinais. Atualmente, a adulteração de plantas medicinais sofre dos seguintes motivos: 1) a morfologia semelhante das plantas medicinais dificulta sua identificação e uso correto 1,2,3,4,5, 2) a crescente demanda por plantas medicinais tem levado a uma oferta insuficiente no mercado 6,7, 3) as plantas medicinais são caras e têm preços flutuantes, e o uso de ervas baratas em vez de materiais economicamente valiosos levou à adulteração e ao lucro do mercado 8,9. Para resolver os problemas de identificação e uso adequados de plantas medicinais, há necessidade de uma tecnologia que permita que não especialistas identifiquem a fonte10.

Existem limitações para identificar e usar adequadamente as plantas medicinais apenas pela aparência e odor11. Para identificação e controle de qualidade mais precisos, são empregados métodos físico-químicos12. A cromatografia em camada delgada (TLC), por exemplo, é um método rápido para identificar ervas medicinais e está incluída na Farmacopeia Chinesa. No entanto, requer padrões de referência para identificar as plantas13. A cromatografia líquida de alta eficiência (HPLC) pode realizar testes qualitativos e quantitativos, tornando-a adequada para testes de qualidade de medicamentos. No entanto, esse instrumento é caro e requer conhecimento especializado para operar14,15. A tecnologia de código de barras de DNA é uma tecnologia de identificação de espécies rápida e precisa que identifica espécies usando sequências de DNA estáveis para diferenciar plantas com morfologia semelhante. Hebert et al. propuseram a tecnologia de código de barras de DNA para identificar espécies, que usa uma sequência de DNA reconhecida e relativamente curta dentro do genoma16, Chen et al. propuseram ITS2 como uma sequência universal para a identificação molecular de plantas medicinais e identificaram mais de 6600 plantas e encontraram uma alta capacidade de identificação17. O estudo de plantas medicinais com base em fragmentos de genes de ITS2 e cloroplastos demonstrou a capacidade de distinguir espécies em nível de espécie, com aplicações nas áreas de proteção de recursos, regulação de mercado e comércio internacional 17,18,19. A aplicação do código de barras de DNA pode superar as limitações dos métodos tradicionais de identificação, o que é útil para garantir a qualidade e segurança das plantas medicinais, evitando abuso de recursos e confusão20. Tem se mostrado benéfico para o estudo de plantas medicinais, apoiando o crescimento da indústria fitoterápica de maneira sustentável e fornecendo uma garantia de que o consumidor usa o medicamento correto 21,22,23,24.

O artigo descreve protocolos de como aplicar o código de barras de DNA para identificar plantas medicinais usando A. sinensis como exemplo. O código de barras de DNA utiliza um ou mais marcadores genéticos curtos padronizados no DNA de um organismo para reconhecê-lo como pertencente a uma espécie específica. Os métodos atuais para identificar plantas medicinais têm certas limitações. A identificação morfológica tradicional depende muito da vasta experiência dos especialistas, que pode ser influenciada por fatores humanos, enquanto a identificação química é propensa a problemas como a adulteração de compostos-chave. Em contraste, o código de barras de DNA fornece um meio mais preciso de identificação de espécies, oferecendo vantagens como velocidade, alta reprodutibilidade e estabilidade. Além disso, essa tecnologia permite o gerenciamento centralizado e o compartilhamento de dados de sequência de espécies existentes por meio da internet e plataformas de informação, melhorando significativamente a eficiência e a confiabilidade da identificação de espécies11,12. Devido à sua morfologia e partes medicinais semelhantes, A. sinensis é frequentemente confundido com outras espécies e é frequentemente mal utilizado ou intencionalmente substituído no mercado25. Yang et al. identificaram A. anomala usando código de barras de DNA para distingui-lo de drogas falsas26. Yuan et al. coletaram 23 espécies de Angélica e usaram código de barras de DNA para diferenciar entre as várias espécies27. Seguindo os procedimentos descritos neste protocolo, os usuários poderão autenticar materiais medicinais à base de plantas desde o pré-processamento até a correspondência da sequência de código de barras com o banco de dados de código de barras (Figura 1).

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Protocolo

1. Preparação da amostra

  1. O presente estudo utilizou A. sinensis , de dois anos de idade, com baixa temperatura e longa luz do sol, a uma altitude de 2800 m do condado de Min, província de Gansu, como materiais experimentais. Foram selecionadas três plantas, das quais mais de três raízes foram selecionadas para experimentação. Enxágue as raízes primeiro com água esterilizada e depois limpe-as com um pulverizador de álcool ou cotonetes com álcool para evitar contaminação que possa afetar a precisão dos resultados experimentais. Corte as raízes em pedaços menores que 5 mm usando um bisturi esterilizado e misture para análise posterior. (Figura 2).
    NOTA: Como alternativa, coloque as raízes em nitrogênio líquido para ficarem crocantes, tornando-as mais fáceis de quebrar. Dependendo da forma, dureza e outras características das plantas medicinais, use instrumentos para lidar com elas.
  2. Preparar três tubos de amostras experimentais para experiências paralelas. Rotule cada amostra como AS-1, AS-2 e AS-3. Pegue cerca de 100 mg de tecido fresco ou 20 mg de tecido seco (seco ao ar) e coloque-o em um tubo de centrífuga de 2 mL.
  3. Coloque dois grânulos de aço inoxidável de 5 mm nos tubos de centrífuga de 2 mL. Transfira os tubos para um triturador de papel tissue de alto rendimento operando a 60 Hz por 60 s.

2 Extração de DNA da amostra

NOTA: Este estudo utiliza um Kit de Extração de DNA Genômico de Plantas, que é baseado no método CTAB. A extração de DNA é realizada seguindo o manual de instruções com algumas modificações, incluindo a adição de um tampão de isolamento nuclear (NIB) exclusivo. O protocolo melhora a pureza do DNA separando primeiro os contaminantes do tecido e, em seguida, adicionando uma etapa inicial de isolamento de núcleos 28,29,30.

  1. Adicione 800 μL de NIB pré-resfriado e coloque a amostra em um misturador de vórtice, vibrando por 5 min.
  2. Coloque em uma centrífuga e processe a 13.780 x g por 10 min. Remova o sobrenadante.
  3. Repita as etapas 2.1-2.2 por mais 3 rodadas.
    NOTA: O NIB extrai DNA de alta qualidade e sua preparação contém alguns produtos químicos perigosos que devem ser manuseados em uma hotte, dificultando o manuseio pelos novatos. No entanto, esta etapa não é obrigatória. Os usuários podem optar por seguir esta recomendação ou pular essas etapas. Sua formulação detalhada está na Tabela 1.
  4. Adicione 600 μL de tampão P1 e 5 μL de RNase A (10 mg / mL). Coloque a amostra em um misturador de vórtice e vórtice para misturar. Incubar as amostras em banho-maria a 65 °C por 1,5 h, invertendo os tubos 2x-3x durante a incubação.
  5. Adicione 200 μL de tampão P2, misture bem, coloque no gelo por 15 min e centrifugue a 13.780 x g por 10 min.
  6. Aspirar cuidadosamente o sobrenadante para uma coluna de filtro AF, centrifugar a 13.780 x g durante 2 min e transferir o filtrado inferior recolhido no tubo de recolha para um novo tubo de centrifugação de 1,5 ml.
  7. Calcule o volume do filtrado, adicione 1,5x o volume de P3 e agite imediatamente para obter uma solução misturada.
  8. Adicione 650 μL da mistura preparada a uma coluna de adsorção adsorvente (AC) e incube por 5 min, depois centrifugue a 13.780 x g por 30-60 s.
  9. Adicionar novamente o filtrado obtido no passo 2.8 à CA, centrifugar e eliminar o líquido residual. Repita o procedimento com a solução misturada restante da etapa 2.7.
  10. Adicione 600 μL de solução de enxágue WB, centrifugue a 13.780 x g por 30 s, descarte a solução residual e repita o procedimento 1x.
  11. Colocar a coluna AC de volta no tubo de recolha vazio, centrifugar a 13.780 x g durante 2 min e deixar à temperatura ambiente para remover o etanol residual.
  12. Pegue a coluna adsorvente AC e coloque-a em um tubo de centrífuga limpo de 1,5 mL. Adicione 45 μL de água deionizada esterilizada (ddH2O) ao meio da membrana adsorvente, que foi aquecida a 65 °C. Deixe em temperatura ambiente por 5 min. Centrifugue a 13.780 x g por 2 min.
  13. Adicione a solução resultante de volta à coluna e centrifugue a 13.780 x g por 2 min à temperatura ambiente.
  14. Recolha a solução filtrada. Use um espectrofotômetro para determinar a concentração de DNA; OD260 representa a absorbância de ácidos nucléicos. Use os seguintes critérios para o padrão de determinação da qualidade do DNA: OD260 / OD280 = 1,80-2,00, a faixa normal; OD260/OD280>2.00; há uma grande quantidade de contaminação por RNA; OD260 / OD280 < 1,80, existem proteínas, fenóis e outros contaminantes.

3 Amplificação e detecção de fragmentos de alvo

NOTA: Selecione os primers de amplificação apropriados com base nas regiões de código de barras de DNA propostas pela planta; as condições de reação são mostradas na Tabela 2.

  1. Configure as condições de reação correspondentes à amplificação do primer. Use tubos de centrífuga de 0,2 mL cheios de 9,5 μL de ddH2O, 12,5 μL de 2x PCR Master Mix e 1 μL de primer direto, primer reverso e DNA molde para um volume total de 25 μL. Prepare um controle negativo, substituindo o molde por água.
  2. Adicione 20 mL de tampão 1x Tris Acetato-EDTA (TEA) e 0,2 g de agarose para aquecer e prepare um gel de agarose a 1%, em seguida, adicione 2 μL de corante de gel de ácido nucleico (10.000x) e misture bem. Despeje a mistura em uma bandeja de fundição de gel e deixe solidificar para obter o gel de agarose. Adicione 3 μL do produto de PCR e 2 μL de marcador de DNA 5000 pb ao gel.
  3. Defina a tensão em 120 V, a corrente em 400 mA e eletroforese por 40 min. Use um sistema versátil de análise de imagem de gel para visualizar géis e verificar os resultados.

4. Coleta e análise dos dados

NOTA: Existe uma ampla gama de software de montagem e análise de sequências; usamos o código Codon Aligner V11.0.1 e MEGA11 como exemplos para ilustração.

  1. Use o alinhador para abrir o arquivo de sequenciamento para observar o mapa de pico e unir os arquivos de mapa de pico de sequenciamento bidirecional.
    1. Selecione Criar um novo projeto e clique em OK para ir para a página inicial do software. Selecione Adicionar Amostras no menu Arquivo, selecione o Arquivo a ser processado como formato de rastreamento de sequência e importe-o diretamente para o software como o arquivo importado em Amostras Desmontadas.
    2. Escolha Contig e, na seção, escolha Montagem avançada e, em seguida, escolha Montar em grupos. Os usuários iniciantes, depois de selecionar Montar em grupos, verão esta caixa de diálogo: Escolha Definir nomes. Modifique as partes Definir nome de amostra de acordo com o nome do arquivo e clique em Montar. A sequência alinhada será exibida.
    3. Recupere as sequências ITS2 completas de acordo com a análise de modelo baseada no modelo oculto de Markov (HMM). Use as sequências 5.8s (CGAGGGCACGCCTGCCTGCCTGGGCGTCA) e 28s (CGACCCCAGGTCAGGCGGGGCCACC)31 para pesquisar a sequência alinhada desde o início para remover as regiões 5.8s e 28s.
    4. Selecione Ir e, na seção, selecione Sequência de Pesquisa e clique em OK para obter a sequência correspondente. Escolha Contig, escolha Excluir na seção para remover as regiões 5.8s e 28s e as sequências de baixa qualidade e, em seguida, o software produzirá as sequências de emenda para correspondência.
  2. Use as sequências de splicing obtidas das três etapas experimentais paralelas para identificação, selecione a pesquisa BLAST usando o banco de dados de nucleotídeos no National Center for Biotechnology Information (NCBI) e selecione a Ferramenta de Identificação de Espécies e o Specific Primer ITS2 correspondente no banco de dados do Banco de Dados do Genoma da Farmacopeia Global (GPGD).
    NOTA: O NCBI32 e o GPGD33 incluem as sequências de nucleotídeos de plantas e animais medicinais e são reconhecidos como bancos de dados confiáveis. Seus principais métodos de identificação são os métodos baseados na comparação de sequências34 (BLAST). A identidade percentual dos resultados de identidade é usada para determinar se a espécie com maior semelhança é o gênero alvo.
  3. Use MEGA11 para alinhamento de sequência, analise e compare a variação de sequência intraespecífica e interespecífica e construa uma árvore filogenética de junção de vizinhos.
    1. Faça o download das sequências de três espécies de Angélica e uma espécie de Peucedanum praeruptorum como um grupo externo do NCBI. Analise essas sequências juntamente com a sequência de resultados obtida.
    2. Clique em Arquivo, escolha Abrir um arquivo/sessão para importar o arquivo e uma caixa de diálogo será exibida. Escolha Align > DNA e selecione Align by ClustalW para comparação de sequência. Escolha Análise filogenética em dados e retorne à página inicial. Clique em Construir/Testar árvore de junção de vizinhos em FILOGENIA. O software gera uma árvore filogenética.

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Resultados

Qualidade do DNA da amostra

A faixa de taxas de absorbância OD260 / OD280 foi de 1,80-1,84. A quantidade de DNA medida por espectrofotômetro para cada amostra foi superior a 100 ng/μL (Tabela 3), indicando uma boa qualidade da extração do DNA da amostra. Isso indica que as amostras não foram contaminadas por proteínas, RNA ou reagentes durante o processo de extração e que eram de boa qualidade e adequadas para amplifi...

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Discussão

A tecnologia de identificação molecular é mais fácil de aprender e dominar do que os métodos tradicionais de identificação. Ele supera as limitações da identificação de ervas medicinais tradicionais, pois não é afetado pelo estágio de crescimento da planta e não depende de julgamento subjetivo ou do acúmulo de conhecimento especializado35. Outras espécies são confundidas com A. sinensis devido à sua morfologia e partes medicinais semelh...

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Divulgações

Os autores declaram que a pesquisa foi conduzida na ausência de quaisquer relações comerciais ou financeiras que pudessem ser interpretadas como um potencial conflito de interesses.

Agradecimentos

Este trabalho foi apoiado por introduz a talentosa pessoa projeto de subsídio de fundos de início de pesquisa científica da Universidade de Medicina Tradicional Chinesa de Chengdu (030040015).

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Materiais

NameCompanyCatalog NumberComments
CTAB Rapid Plant Genomic DNA Extraction KitShanghai Huiling Biotechnology Co.NG411MSuitable for rapid extraction of high quality genomic DNA from different tissues of a wide range of plants
DL5000 DNA MarkerNanjing vazyme Bio-technology Co.MD102-02Ready-to-use product, take an appropriate amount of this product directly for electrophoresis when running the gel.
ElectrophoresisBeijing Liuyi Biotechnology Co.DYY-6CAdopt touch screen design, can display set voltage, set current at the same time, parallel output
Ethylenediaminetetraacetic acidBeijingpsaitongBiotechnologyCo.,LtdE70015-100GNuclear Isolation Buffer formulation reagents.
Goldview Nucleic Acid Gel Stain(10,000×)Yisheng Biotechnology (Shanghai) Co., Ltd10201ES03When using agarose gel electrophoresis to detect DNA, it binds to DNA and produces a strong fluorescent signal.
High-Speed Tabletop CentrifugeChangsha High-tech Industrial Development Zone Xiangyi Centrifuge Instrument Co.H1650For fast and efficient separation of samples, this compact and lightweight centrifuge offers reliable safety
High-Throughput Tissue GrinderShanghai Jingxin Industrial Development Co.Tiss-48A high-frequency vibration instrument for grinding samples
http://www.gpgenome.com/Institute of Chinese Materia Medica, China Academy of Chinese Medical Sciences-HerbGenomics database includes genome sequences, gene sets, organelle genomes, low coverage genome data and DNA barcode sequences.
https://www.ncbi.nlm.nih.gov/U.S. National Library of Medicine-The National Center for Biotechnology Information advances science and health by providing access to biomedical and genomic information.
Kylin-BellHaimen Qilinbel Instrument Manufacturing Co.VORTEX-5Rapid mixing in the form of a high-speed vortex, mixing speed, uniformity, thoroughness
LifeTouchHangzhou BORI Technology Co.TC-96/G/H(b)BAdoption of advanced thermoelectric refrigeration technology and newly created TAS technology to enhance its overall performance
Multi-functional Gel Image Analysis SystemSouthwest Operation Center of Shanghai Tianneng Life Science Co.Tanon-Mini Space 2000Performs rapid gene amplification experiments with a gradient function for mapping amplification conditions and a gradient temperature range of up to 30°C
NaClBeijing Solarbio Science&Technology Co.,Ltd.S8210-100Nuclear Isolation Buffer formulation reagents.
Nanodrop OneGenes Ltd.ND ONEQuantify DNA, RNA and protein samples in seconds with just 1-2 µL of sample
Polyvinyl pyrrolidoneShanghai yuanye Bio-Technology Co., LtdS30268-500gNuclear Isolation Buffer formulation reagents.
Snowflake Ice MakerShanghai Zhixin Experimental Instrument Technology Co.ZX-60XAdopting rotary extrusion ice making method, fast ice making speed and high efficiency of ice production
Stainless Steel Beads for Tissue HomogenizerBeyotime Biotechnology. F6623Equipment for grinding and mixing of tissue and other samples by vibration
Tris Acetate-EDTA bufferBeyotime Biotech IncST716TAE is a commonly used buffer for DNA electrophoresis, frequently employed in agarose gel electrophoresis.
Tris-HClBeijing Solarbio Science&Technology Co.,Ltd.T8230Nuclear Isolation Buffer formulation reagents.
Water bath KettleShanghai Senxin Experimental Instrument Co.DK-8DPrecise thermostat and temperature regulation, accurate and reliable temperature control
β-mercaptoethanolShanghai Eon Chemical Technology Co.R054186-100ml  Nuclear Isolation Buffer formulation reagents.

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