Uma abordagem para a construção de comunidades de biofilme multiespécies a partir do solo da rizosfera

Resumo

Um procedimento rápido e padronizado para estabelecer comunidades sinérgicas de biofilmes multiespécies de vários solos da rizosfera é apresentado aqui. É um protocolo único projetado para sondar e simular a complexa microbiota do solo da rizosfera.

Resumo

O biofilme multiespécie é um estilo de vida natural e dominante de bactérias na natureza, inclusive no solo da rizosfera, embora a compreensão atual seja limitada. Aqui, fornecemos uma abordagem para estabelecer rapidamente comunidades sinérgicas de biofilmes multiespécies. O primeiro passo é extrair células do solo da rizosfera usando o método de centrifugação diferencial. Posteriormente, essas células do solo são inoculadas no meio de cultura para formar biofilme de película. Após 36 h de incubação, a composição bacteriana do biofilme e a solução abaixo são determinadas usando o método de sequenciamento de amplicon do gene 16S rRNA. Enquanto isso, o isolamento bacteriano de alto rendimento do biofilme da película é realizado usando o método de diluição limitante. Em seguida, os 5 principais táxons bacterianos são selecionados com a maior abundância nos dados de sequenciamento do amplicon do gene 16S rRNA (amostras de biofilme da película) para uso posterior na construção de comunidades de biofilme multiespécies. Todas as combinações dos 5 táxons bacterianos foram rapidamente estabelecidas usando uma placa de 24 poços, selecionada para a maior capacidade de formação de biofilme pelo ensaio de coloração violeta de cristal e quantificada por qPCR. Finalmente, as comunidades de biofilme multiespécies bacterianas sintéticas mais robustas foram obtidas através dos métodos acima. Esta metodologia fornece orientação informativa para a realização de pesquisas sobre biofilme multiespécies da rizosfera e identificação de comunidades representativas para o estudo dos princípios que regem as interações entre essas espécies.

Introdução

Os biofilmes representam comunidades microbianas intrincadas afixadas em superfícies ou ligadas a interfaces. Há um amplo reconhecimento de que a maioria das bactérias encontradas em vários ambientes, como habitats naturais, ambientes clínicos e contextos industriais, perduram dentro de comunidades de biofilme¹. No solo, a rizosfera - abrangendo a superfície da raiz e sua região adjacente de 2 mm de espessura - forma um nicho ecológico com maior disponibilidade de nutrientes. Bactérias específicas desenvolveram estratégias para explorar esse nicho, promovendo a proliferação microbiana e promovendo a formação de comunidades de biofilme na rizosfera².

Os micróbios da rizosfera são considerados o 'segundo genoma' das plantas³. Os microrganismos promotores de crescimento vegetal (PGPM) se envolvem em simbiose mutualística com as plantas, proporcionando funções significativas de promoção do crescimento e biocontrole⁴. Por um lado, o PGPM pode fornecer nutrientes às raízes das plantas, aumentar a absorção de nutrientes, defender contra patógenos e degradar poluentes no solo da rizosfera⁵. Por outro lado, o PGPM utiliza exsudatos radiculares de plantas como fonte de nutrientes para crescimento e evolução, influenciando assim o solo da rizosfera e o sistema radicular por meio de seu próprio metabolismo. Vale ressaltar que o pré-requisito para todas essas funções é a colonização efetiva do PGPM na rizosfera vegetal, formando biofilmes estáveis⁶.

O biofilme da rizosfera afeta o processo de montagem dos micróbios da rizosfera, e as características temporais e espaciais da montagem dos micróbios da rizosfera estão intimamente relacionadas à interação do biofilme multiespécie⁷. Ele serve como o centro de interações planta-microbioma, fornecendo um nicho estável e controlável para que elas interajam de forma eficaz. Portanto, estudar o biofilme da rizosfera também é uma direção importante para obter informações sobre a interação entre plantas e micróbios.

No entanto, atualmente há pouca pesquisa sobre biofilmes multiespécies da rizosfera. A alta complexidade da composição do microbioma torna difícil responder a questões ecológicas fundamentais em torno das comunidades microbianas naturais⁸. No processo de experimentos, muitas condições, como tipo de solo, tipo de planta e o grande número de comunidades microbianas, precisam ser consideradas. Vários fatores limitam a pesquisa de biofilmes multiespécies da rizosfera.

Para investigar ainda mais as comunidades de biofilme multiespécies do solo da rizosfera, como interações sinérgicas interespécies ou alimentação cruzada de metabólitos⁸, é desejável construir artificialmente uma comunidade microbiana sintética simplificada, representativa, estável e tratável em condições de laboratório ^9,10. Aqui, um protocolo padronizado combina várias das mais recentes técnicas microbiológicas e bioinformáticas.

Protocolo

Este protocolo é geralmente aplicável à microbiota do solo rizosférico de várias plantas. Aqui, o pepino é usado como exemplo. Os detalhes dos reagentes e equipamentos usados para o estudo estão listados na Tabela de Materiais.

1. Isolamento bacteriano

1. Isolamento do solo da rizosfera
   1. Cultura do pepino
      1. Desinfete as sementes de pepino com etanol a 75% e solução de hipoclorito de sódio (NaClO) a 2% e enxágue-as em água estéril¹¹.
      2. Germinar as sementes em condições estéreis e selecionar aquelas que atingem o estágio¹² de duas folhas. Posteriormente, transplante as mudas de pepino germinadas consistentemente em vasos contendo 2 kg de terra preta.
         NOTA: Dois tipos de solo preto de diferentes locais no nordeste da China são usados para reduzir erros sistemáticos.
   2. Preparação da suspensão do solo
      1. Preparar o tampão PBS-S utilizando a formulação: 6,33 g de NaH₂PO₄· H₂O, 16,5 g de Na₂HPO₄·7H₂O, 200 μL de Silwet L-77 e 1 L de água destilada.
      2. Quando as mudas atingirem o estágio¹² de quatro folhas, inverta o vaso e isole as raízes junto com o solo da rizosfera de 2 mm de espessura usando luvas esterilizadas.
      3. Coloque as raízes em 30 mL de tampão PBS-S em um tubo de centrífuga de 50 mL. Após agitar por 20 min, filtrar a suspensão através de um filtro de células de nylon de 100 μm para remover raízes e sedimentos grandes.
      4. Transferir o filtrado para outro tubo de centrifugação de 50 ml, centrifugá-lo a 3200 x g durante 15 min à temperatura ambiente e conservá-lo temporariamente a 4 °C.
2. Extração de células bacterianas do solo da rizosfera.
   NOTA: Esta metodologia adota o método de centrifugação diferencial¹³, embora o método de centrifugação com gradiente de densidade de Nycodenz¹⁴ também se aplique a esta etapa.
   1. Diluir a suspensão do solo com uma solução de 0,2% de Na₄P₂O₇ para 500 mL e centrifugar a 1.000 x g por 10 min para separar inicialmente os organismos do solo.
   2. Homogeneizar novamente o precipitado, centrifugá-lo na mesma velocidade baixa por 60 s e repetir o processo três vezes. Combine os sobrenadantes, centrifugue-os a 12.000 x g por 20 min e depois descarte o sobrenadante.
   3. Ressuspender o precipitado em 50 mL de tampão PBS-S, constituindo a suspensão de células bacterianas do solo da rizosfera.

2. Sequenciamento e identificação da microbiota do biofilme da rizosfera

1. Preparação de mídia
   NOTA: Os meios de caldo de soja tríptico (TSB) e glutamato de glicerol de sais mínimos (MSgg) estão disponíveis comercialmente. As formulações abaixo são apenas para referência.
   1. Prepare o meio TSB usando a seguinte formulação: 15 μg / mL de triptona, 5 μg / mL de peptona de soja, 5 μg / mL de NaCl, pH = 7.
   2. Prepare o meio MSgg usando a seguinte formulação: 5 mM KH₂PO₄, 100 mM de ácido propanosulfônico 3-(N-morfolino) (MOPS), 2 mM MgCl₂, 700 μM CaCl₂, 50 μM MnCl₂, 50 μM FeCl₃, 1 μM ZnCl₂, 2 μM de tiamina, 0,5% de glicerol, 0,5% de glutamato, 50 μg/mL de triptofano, 50 μg/mL de fenilalanina, pH = 7.
   3. Para preparar o meio TSB-MSgg, misture o meio TSB com o meio MSgg na proporção de 1:1 (v/v)¹⁵.
2. Cocultura de biofilme de película
   1. Incubar a suspensão celular em meio TSB a 30 °C durante a noite (geralmente 12 h) para ativar a bactéria.
   2. Coloque filtros de células de nylon de 100 μm em placas de 24 poços. Incube as bactérias em meio TSB e estabeleça três repetições. Cultivar o biofilme da película durante 36 h a 30 °C.
      NOTA: Se o biofilme da película da última etapa não for bem cultivado, o meio TSB-MSgg é um substituto eficaz para o meio TSB.
   3. Remova o filtro que contém o biofilme da película. Adicione 2 mL de tampão PBS-S a uma nova placa de células de 24 poços, coloque o filtro de 24 poços nela para lavar o biofilme e remova as células livres. Repita o processo de lavagem três vezes.
3. Extração de DNA de biofilme de película
   1. Extraia o genoma do biofilme usando um kit de DNA seguindo as instruções do fabricante.
4. Sequenciamento de alto rendimento
   NOTA: As empresas de biotecnologia podem ajudar a concluir experimentos de sequenciamento para a maioria dos laboratórios. Se for necessária a composição microbiana na solução restante, sequencie-a nesta etapa. A etapa de sequenciamento varia de acordo com os instrumentos. Por favor, siga as instruções do fabricante. A etapa 2.4.1 é apenas para referência.
   1. Amplificar as regiões V3-V4 do gene 16S rRNA com base no banco de dados com sequências completas do gene 16S rRNA. Criar OTUs de espécies de acordo com o número mínimo de sequências por amostra¹⁶. Agrupe as anotações de classificação de espécies e adquira as composições das comunidades de cada amostra.
   2. Com base nos dados de sequenciamento, selecione as cinco principais cepas em termos de abundância relativa.
5. Isolamento e cultura bacteriana de alto rendimento
   NOTA: Esta etapa é projetada de acordo com a mais recente metodologia microbiológica e bioinformática¹⁷. O método de placa revestida por diluição está disponível para isolamento bacteriano aqui, embora seja mais demorado e menos direcionado em comparação com as técnicas de alto rendimento.
   1. Misture o biofilme cultivado. Use diluição limitante para garantir que não mais do que 30% dos poços na placa de 24 poços apresentem crescimento bacteriano.
      NOTA: Para determinar a diluição mais adequada, realize experimentos preliminares usando uma ampla gama de taxas de diluição. A diluição ideal não deve conter mais do que duas bactérias cultiváveis por mililitro, representando a incubação bacteriana em menos de 30% dos poços.
   2. Amplifice o gene 16S rRNA da bactéria enquanto adiciona rótulos para os poços e placas e sequencie-os usando a plataforma Illumina¹⁷ de alto rendimento.
   3. Realizar análises de bioinformática usando software disponível comercialmente para obter informações taxonômicas de pureza e espécies para cada cultura.
   4. Cultive as cinco principais bactérias puras abundantes por cultura de linha contínua e use glicerol para preservar as bactérias a -80 °C.

3. Construção de comunidades microbianas sintéticas

1. Cultura de biofilme reconstruída
   NOTA: Para obter detalhes, consulte Ren et ^al.18. As 5 cepas correspondem a 31 combinações sintéticas, incluindo 5 consórcios de uma única espécie, 10 de duas espécies, 10 de três espécies, 5 de quatro espécies e 1 de cinco espécies.
   1. Incube as 5 cepas no meio TSB até que seu OD₆₀₀ atinja 1 para ativá-las.
   2. Prepare várias placas de 24 poços com meio TSB e coloque filtros de células de nylon de 100 μm sobre elas.
      NOTA: Se o biofilme da última etapa não for bem cultivado, o meio TSB-MSgg é um substituto eficaz para o meio TSB.
   3. Incubar as 31 combinações de comunidades sintéticas no meio. Certifique-se de que o número de bactérias da inoculação seja consistente em cada poço. Configure três repetições para cada combinação.
   4. Cultivar o biofilme a 30 °C durante 36 h.
2. Quantificação do biofilme da película
   1. Siga o mesmo procedimento da etapa 2.2.3.
   2. Transfira o biofilme para uma nova placa de 24 poços contendo 180 μL de solução de cristal violeta e core-o por 20 min.
   3. Transfira a amostra corada para outra placa de 24 poços contendo 200 μL de etanol a 96%, elua por 30 min e meça OD₅₉₀.

4. Quantificação do número de células da película

NOTA: Para determinar a proporção de cada espécie e a contagem de células na película e na solução restante, é necessária uma PCR quantitativa. Para obter detalhes, consulte Sun et ^al.16.

1. Projete primers específicos para as comunidades microbianas sintéticas selecionadas.
2. Use Roary para realizar comparações de genoma e descobrir os genes de cópia única específicos da cepa de cada isolado. Certifique-se de que os primers sejam direcionados a esses genes.
3. Ligue os fragmentos amplificados para plasmídeos PMD19T. Gere curvas padrão usando os plasmídeos que contêm fragmentos correspondentes como modelos.
4. Siga as mesmas etapas mencionadas na etapa 2.2.
5. Prepare os componentes da reação da seguinte forma: 7,2 μL de H₂O, 10 μL de 2x qPCR Master mix, 0,4 μL de 10 μM de cada primer e 2 μL de DNA molde.
6. Realize a PCR com um instrumento de PCR em tempo real nas seguintes condições: 95 °C por 10 min, 40 ciclos de 95 °C por 30 s e 60 °C por 45 s, seguidos por um segmento de curva de fusão padrão.
7. Realizar seis repetições biológicas para cada tratamento.

Resultados

Seguindo o procedimento mencionado, são observados gradientes significativos na capacidade de formação de biofilme da microbiota do solo da rizosfera do pepino (Figura 1). O sequenciamento do amplicon do biofilme confirmou a espécie na película (Figura 2). Com base no mapeamento de calor dos dados de sequenciamento, foram selecionadas as cinco principais espécies bacterianas cuja abundância na película é maior do que na solução restante (

Discussão

Seguindo o protocolo, uma série de comunidades robustas de biofilmes sintéticos multiespécies são construídas com base na microbiota no solo da rizosfera de diferentes plantas. Usando técnicas de PCR quantitativas, a composição de cada comunidade é decifrada claramente. A biomassa do biofilme indica a força de suas potenciais interações metabólicas, embora várias propriedades e mecanismos por trás da cooperação não possam ser revelados aqui¹⁹. Dado o tamanho e a complexidade das ...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.2 % Na4P2O7 solution	Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd.	20041418	Used to dilute the soil suspension.
100 μm Nylon Cell Filter	Sangon Biotech (Shanghai) Co.,Ltd.	F613463-0001	Used to filter culture solution and separate pellicle biofilm.
2% NaClO solution	Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd.	L03336903	Used to sterilize the seeds.
24-well Plate	Merck & Co., Inc.	PSRP010	Used for micobial cultivation and pellicle biofilm separation.
3-(N-morpholino) propane sulfonic acid (MOPS)	Bioolook Scientific Research Special	2360010	Used to prepare MSgg media.
50 mL Centrifuge Tube	Beijing Su-bio Biotech Co., Ltd.	62.547.254	Properly-sized centrifuge tubes for our protocol.
75% C2H5OH solution	Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd.	801769680	Used to sterilize the seeds.
Acinetobacter baumannii XL-1	Nanjing Agricultural University	N/A	Strains isolated from rhizosphere soil.
Bacillus velezensis SQR9	Nanjing Agricultural University	N/A	Strains isolated from rhizosphere soil.
Bacteria DNA Kit	Nanjing Dinsi Biotechnology Co.,Ltd.	D3350020000K04U021	Used to extract bacterial DNA.
Black Soil I	Nanjing Agricultural University	N/A	Black soil from Jilin Province.
Black Soil II	Nanjing Agricultural University	N/A	Black soil from Heilongjiang Province.
Burkholderia cenocepacia XL-2	Nanjing Agricultural University	N/A	Strains isolated from rhizosphere soil.
CaCl2	Xilong Scientific Co.,Ltd.	10035048	Used to prepare MSgg media.
Centrifuge	Sangon Biotech (Shanghai) Co.,Ltd.	G508009-0001	High-speed centrifuge.
ChamQ SYBR qPCR Master Mix	Vazyme Biotech Co.,Ltd.	Q311-02	Used for DNA amplification in qPCR.
Clean Bench	Suzhou Antai Airtech Co., Ltd.	NB026143	Used for aseptic operation.
Constant Temperature Incubator	ShangHai CIMO Medical Instrument Co.,Ltd	GNP-9080BS-	Used for microbial cultivation.
Cristal Violet Dye	Sangon Biotech (Shanghai) Co.,Ltd.	A600331	Used for pellicle biofilm staining and quantifivation.
Cucumber Seed	Nanjing Agricultural University	N/A	"Jinchun I" cucumber seed.
Culturome v 1.0	The Institute of Genetics and Developmental Biology of the Chinese Academy of Sciences	N/A	Used for high-throughput rhizosphere soil bacterial cultivation and identification
FeCl3	Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd	10011918	Used to prepare MSgg media.
Fridge	Hefei Midea Refrigerator Co.,Ltd.	BCD-556WKPM(Q)	Used for strain preservation.
Glutamate	Bioolook Scientific Research Special	2180020	Used to prepare MSgg media.
Glycerol	Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd	10010618	Used to prepare MSgg media.
Hydroponic Planting Basket	Yulv Furniture Store	6526262626	Used for cucumber hydroponics.
KH2PO4	Xilong Scientific Co.,Ltd.	10017618	Used to prepare MSgg media.
MgCl2	Xilong Scientific Co.,Ltd.	7791186	Used to prepare MSgg media.
MnCl2	Xilong Scientific Co.,Ltd.	10400101	Used to prepare MSgg media.
Msgg Medium	Shanghai Bioesn Biotechnology Co.,Ltd.	BES20791KB	Pellicle biofilm culture medium.
Na2HPO4·7H2O	Merck & Co., Inc.	S9390-100G	Used to prepare TSB media.
NaCI	Chinasun Specialty Products co., Ltd.	HS0416	Used to prepare TSB media.
NaH2PO4·H2O	Merck & Co., Inc.	S9638-25G	Used to prepare TSB media.
PBS-S Buffer	Sangon Biotech (Shanghai) Co.,Ltd.	E607008-0001	Basic buffer for living tissues.
Phenylalanine	RYON	RT3486L005	Used to prepare MSgg media.
Pipette	Beijing Labgic Technology Co.,Ltd.	BS-1000-T	Used for strain inoculation.
PMD19T Plasmid	Takara Biomedical Technology (Beijing) Co.,Ltd.	D102A	Used to generate qPCR standard curves.
Pot	Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd.	YHHWS2401	Used for cucumber soil culture.
Primer for qPCR	Sangon Biotech (Shanghai) Co.,Ltd.	N/A	Used for DNA amplification in qPCR.
Real-Time PCR Instrument	Thermo Fisher Scientific (China) Co.,Ltd.	4484073	Used to perform qPCR on selected pellicle biofilm.
Roary	The Wellcome Trust SangerInstitute	N/A	Used to design primers of qPCR
Shaker	Shanghai Zhichu Instrument Co.,Ltd	ZQTY-50S	Used for solution mixing and microbial cultivation.
Silwet L-77	Cytiva Bio-technology(Hangzhou) Co., Ltd.	SL77080596	Used to prepare TSB media.
Soy peptone	Qingdao Hi-tech Industrial Park Hope Bio-technology Co., Ltd	HB8275	Used to prepare TSB media.
Spectrophotometer	Shanghai Yidian Analysis Instrument Co.,Ltd.	76713100010	Used for pellicle biofilm cristal violet quantifivation.
Sterile Water	Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd.	SW150302	Used to wash the pellicle biofilm.
Sterilized Nitrile Gloves	Beijing Labgic Technology Co.,Ltd.	223016852LLZA	Used for basic experimental operations.
Template DNA	Sangon Biotech (Shanghai) Co.,Ltd.	N/A	Used for DNA amplification in qPCR.
Thiamine	Bioolook Scientific Research Special	2180020	Used to prepare MSgg media.
Tryptone	Thermo Fisher Scientific	LP0042B	Used to prepare TSB media.
Tryptophan	Bioolook Scientific Research Special	2190020	Used to prepare MSgg media.
TSB Medium	Guangdong Huankai Microbial Sci. & Tech. Co.,Ltd.	024048	Broad-spectrum bacterial medium.
TSB-Msgg Meidium	Nanjing Agricultural University	N/A	Mixed medium for pellicle biofilm culture with wider applicability.
ZnCl2	Nanjing Chemical Reagent Co.,Ltd	C0310520123	Used to prepare MSgg media.