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Resumo

O presente protocolo descreve um método para administração intranasal de agregados de α-sinucleína. Este método fornece informações sobre a propagação da α-sinucleína da mucosa olfatória para o bulbo olfatório na doença de Parkinson.

Resumo

A doença de Parkinson (DP) é um distúrbio neurodegenerativo caracterizado pela presença de corpos de Lewy, que são agregados de α-sinucleína (α-Syn). Recentemente, foi proposto que a doença se desenvolvesse e progredisse através da propagação semelhante a príons de agregados de α-Syn a partir do bulbo olfatório (OB) ou núcleo dorsal do nervo vago. Embora a origem dos agregados de α-Syn no OB permaneça obscura, sua propagação a partir da mucosa olfatória foi recentemente sugerida. Mostramos anteriormente que a administração intranasal de agregados de α-Syn em um modelo de camundongo induziu a patologia α-Syn no BO de camundongos. Neste estudo, apresentamos um método de administração intranasal de agregados de α-Syn que induziu a patologia α-Syn no BO de camundongos. A administração intranasal de agregados de α-Syn é um método muito simples e direto, e acreditamos que será uma ferramenta útil na pesquisa para elucidar a origem da patologia α-Syn no BO e a via de propagação do α-Syn através do sistema olfatório.

Introdução

A doença de Parkinson (DP), caracterizada por sintomas motores como bradicinesia, tremores em repouso e rigidez muscular, é o segundo distúrbio neurodegenerativo maiscomum1. A DP também apresenta sintomas não motores, incluindo disfunção olfatória, comprometimento cognitivo, depressão, alucinações, constipação e hipotensão ortostática. Suas características patológicas são a morte celular dopaminérgica na substância negra e a presença de agregados de α-sinucleína (α-Syn), denominados corpos de Lewy2.

É importante notar que o α-Syn é uma proteína de 140 aminoácidos que existe na forma de um monômero solúvel (ou tetrâmero) em condições normais. No entanto, em condições anormais, o monômero solúvel é convertido em agregados insolúveis de alto peso molecular, incluindo oligômeros e fibrilas. A transição de α-Syn em oligômeros e fibrilas está supostamente envolvida na toxicidade celular3.

Estudos recentes sugeriram a propagação semelhante a príons de agregados α-Syn entre os neurônios. Com base em vários exames post-mortem, Braak et al. propuseram em 2003 a hipótese de que a patologia dos corpos de Lewy se espalha progressivamente no cérebro de maneira um tanto estereotipada (hipótese de Braak)4,5. Em 2008, o exame post-mortem de pacientes com DP que receberam transplantes de mesencéfalo fetal revelou corpos de Lewy em neurônios dopaminérgicos derivados de tecidos fetais 6,7. Esses estudos sugeriram que os agregados de α-Syn poderiam se espalhar do cérebro doente para os enxertos, apoiando a hipótese de Braak.

Após essas observações, experimentos envolvendo culturas neuronais primárias e injeção intracerebral de agregados de α-Syn em camundongos reproduziram a disseminação de agregados semelhantes a corpos de Lewy, fornecendo mais evidências para a propagação de α-Syn de maneira semelhante a príons 8,9.

Braak et al. mostraram que a patologia dos corpos de Lewy na DP inicia-se no bulbo olfatório (BO) e/ou no núcleo dorsal do nervo vago (dmX)4. Com base na hipótese de Braak, vários estudos relataram a administração de agregados de α-Syn ou extratos de corpos de Lewy de cérebros com DP no trato gastrointestinal e gastrointestinal de animais experimentais 10,11,12. Em 2018, um estudo demonstrou que a administração de agregados de α-Syn no BO de camundongos selvagens induziu a propagação da patologia α-Syn ao longo da via olfatória, resultando em disfunção olfatória13. Anteriormente, inoculamos agregados de α-Syn no OB de camundongos transgênicos α-Syn e descobrimos que isso levou à atrofia do hipocampo e comprometimento da memória14.

Em 2022, inoculamos agregados de α-Syn no OB de saguis, um pequeno primata não humano; isso resultou na propagação da patologia α-Syn ao longo da via olfatória, atrofia do OB e hipometabolismo cerebral generalizadoda glicose 10.

No entanto, se a propagação de agregados α-Syn ocorre a partir do OB, surge uma questão crítica: por qual mecanismo os agregados α-Syn aparecem inicialmente? Saito et al. relataram anteriormente a presença de corpos de Lewy na mucosa nasal15. A presença de agregados de α-Syn foi detectada na mucosa nasal de pacientes com DP e atrofia de múltiplos sistemas (AMS) por meio de análise de conversão induzida por tremor em tempo real (RT-QUIC)16. Notavelmente, a análise de amostras de mucosa nasal de pacientes com distúrbio comportamental do sono de movimento rápido dos olhos (RBD), que é considerado um estágio prodrômico da DP, revelou um aumento nos níveis de α-Syn17. Este estudo sugeriu que a patologia α-Syn pode existir na mucosa nasal mesmo na fase prodrômica da DP.

Embora esses achados sugiram uma rota potencial da mucosa nasal para o BO, há evidências experimentais limitadas que apoiam esse cenário. Para resolver essa lacuna, administramos agregados de α-Syn na cavidade nasal de camundongos e investigamos a propagação da patologia α-Syn da mucosa nasal para o OB. Nossa abordagem experimental demonstrou que uma administração intranasal de dose única de agregados de α-Syn em camundongos do tipo selvagem induziu a patologia α-Syn no BO, fornecendo evidências experimentais para a via de propagação da mucosa nasal para o OB.

Protocolo

Camundongos machos C57BL/6J de 2 meses de idade foram utilizados para este estudo. Todos os procedimentos experimentais foram realizados de acordo com as diretrizes nacionais. O Comitê de Pesquisa Animal da Universidade de Kyoto concedeu aprovação ética e permissão para este estudo (MedKyo 23.544).

1. Administração intranasal de fibrilas pré-formadas α-Syn

  1. Prepare a solução de fibrilas α-Syn de camundongo em PBS (4 mg / mL) de acordo com os métodos relatados anteriormente11. Enrole o tubo com um filme transparente para evitar contaminação.
  2. Sonicar 200 μL de solução de fibrilas α-Syn para gerar fibrilas pré-formadas α-Syn (PFFs) usando um sonicador do tipo banho-maria (Tabela de Materiais). Encha o banho ultrassônico com água e adicione cubos de gelo para esfriar até 4 °C para sonicação. Sonicar fibrilas por um total de 5 min com cada ciclo consistindo em 30 s de sonicação seguidos por um intervalo de 30 s (um total de cinco ciclos).
    NOTA: Use equipamentos de proteção individual, como luvas descartáveis, máscara e óculos de segurança, para evitar a exposição do α-Syn.
  3. Prepare uma pipeta P10 (Tabela de Materiais) com uma ponta de pipeta de 10 μL. Anestesiar cada camundongo usando uma combinação de cloridrato de medetomidina, midazolam e butorfanol (MMB) por injeção intraperitoneal (ip). O agente anestésico combinado MMB continha midazolam (0,3 mg/kg), medetomidina (4 mg/kg) e tartarato de butorfanol (5 mg/kg). Use 0,005 mL / g por injeção i.p. ao misturar midazolam (1 mg / mL) 0,3 mL, medetomidina (5 mg / mL) 0,8 mL, tartarato de butorfanol (5 mg / mL) 1 mL e solução salina 2,9 mL.
  4. Aguarde 10 minutos para garantir que os ratos estejam completamente anestesiados. A anestesia adequada pode ser confirmada se o camundongo estiver em decúbito lateral e não puder se endireitar. Uma vez anestesiado, aplique pomada oftálmica usando um aplicador de algodão estéril para evitar o ressecamento dos olhos.
    NOTA: Sem anestesia, ao administrar doses nasais, é difícil manter os camundongos em decúbito dorsal e administrar a solução de α-Syn adequadamente enquanto os camundongos espirram. Por essas razões, a sedação foi necessária.
  5. Coloque o mouse anestesiado em decúbito dorsal. Coloque uma toalha de papel ou material similar sob o corpo, garantindo uma leve inclinação da cabeça para baixo (Figura 1A, B). Esse posicionamento evita que a solução de α-Syn administrada flua rapidamente para os pulmões ou esôfago, facilitando sua retenção na cavidade nasal. As narinas são vistas na Figura 1C.
  6. Retire 1 μL de solução de α-Syn (4 mg / mL) em uma pipeta P10 e coloque a ponta da pipeta perto do nariz do camundongo. Forme lentamente uma gota redonda e mantenha-a no final da ponta da pipeta (Figura 1D, seta vermelha). A administração intranasal é realizada para a narina unilateral, use o lado contralateral como lado controle.
  7. Aproxime a gota de um lado das narinas do rato e permita que o rato a inale naturalmente. Observe a inalação e aguarde 30 s a 1 min (Figura 1E).
  8. Repita as etapas 1.6.-1.7. até que seja administrado um volume total de 20 μL de solução de α-Syn. Após todos os procedimentos, descarte as luvas e limpe uma bancada com detergentes comerciais se a superfície estiver contaminada com α-Syn
    NOTA: Todo o procedimento deve ser realizado em um gabinete de segurança para evitar a inalação de fibrilas α-Syn pelo pessoal que realiza o procedimento. Um relatório anterior mostrou que o volume de 25 μL é o mais eficiente para a administração de drogas nariz-cérebro18. Usamos um volume semelhante de 20 μL no presente estudo. Também usamos a mesma concentração de PFFs que a injeção no OB no relatório anterior10, que é próxima aos 400 μM (5,6 mg / mL) dos PFFs19.
  9. Administre atipamezol (3 mg/kg; Tabela de Materiais) por injeção intravenosa para reverter a medetomidina e facilitar a recuperação. Use 0,005 mL / g por injeção i.p. ao misturar atipamezol (5 mg / mL) 0,6 mL e solução salina 4,4 mL.
    NOTA: Forneça analgesia porque não é totalmente compreendido o quão estressante seria a administração intranasal de α-Syn.
  10. Não deixe o rato sem vigilância até que ele tenha recuperado a consciência suficiente para manter a decúbito esternal. Após a recuperação completa, retorne o mouse para a gaiola.

2. Preparação da amostra

  1. Sacrifique os camundongos tratados em 1, 3, 6 e 12 meses após a administração intranasal de fibrilas pré-formadas α-Syn.
    1. Coloque os camundongos na caixa de indução, administre sevoflurano (>6,5%) e continue até que ocorra a parada respiratória por > 60 s. Remova os camundongos e realize uma exsanguinação rápida por incisão no átrio direito para garantir a eutanásia.
  2. Insira uma agulha 25G (Tabela de Materiais) no ápice do coração. Perfunda o camundongo a 4 mL / min com 15 mL de PBS e, em seguida, 15 mL de PFA a 4% em PBS.
  3. Corte a cabeça com uma tesoura e faça uma incisão de 2 cm no couro cabeludo com um bisturi. Incisar o osso craniano com uma tesoura na parte lateral, da parte inferior até o nariz (Figura 2A, B). Para obter as OBs, remova completamente o osso craniano nas OBs (Figura 2B, círculo amarelo).
  4. Vire a cabeça, corte os nervos cerebrais e, em seguida, remova o cérebro cuidadosamente com uma pinça (Figura 2C, D). Obtenha o cérebro com OBs intactos (Figura 2E). Para obter as OBs intactas, corte cuidadosamente os nervos olfatórios com uma pinça enquanto as OBs se ligam ao osso do crânio (Figura 2D, círculo amarelo).
  5. Coloque as amostras de cérebro no PFA a 4% em PBS durante a noite a 4 ° C. Não deixe as amostras cerebrais por mais de 24 horas.
    NOTA: A fixação excessiva diminuirá a coloração imuno-histoquímica. Se for necessário armazenamento de longo prazo, preserve amostras de cérebro em etanol 70% ou PBS contendo 0,1% de azida sódica para manter a esterilidade.

3. Coloração imuno-histoquímica do OB

  1. Parafinizar as amostras usando um processador automático de tecidos (Tabela de Materiais) conforme descrito abaixo.
    1. Mergulhe em etanol 70% por 120 min, seguido de imersão em etanol 100% por 8x por 60 min. Em seguida, mergulhe em xileno 100% por 3x por 120 min.
    2. Mergulhar em parafina a 60 °C durante 120 min, seguido de imersão em parafina a 60 °C durante 240 min.
  2. Incorpore as amostras em parafina conforme descrito abaixo.
    1. Incorporar as amostras em parafina a 60 °C com um centro modular de inclusão de tecido (Tabela de Materiais). Resfrie-os no gelo.
  3. Corte as amostras em seções de 8 μm de espessura com um micrótomo (Tabela de Materiais) 18 .
  4. Execute a desparafinização conforme descrito abaixo.
    1. Mergulhe em xileno 100% por 2x por 5 min, seguido de imersão em etanol 100% por 2x por 3 min.
    2. Mergulhe em etanol 70% por 3 min. Lave em PBS por 3 min.
  5. Realize a recuperação do antígeno conforme descrito abaixo.
    1. Mergulhe em ácido fórmico 100% por 15 min. Enxágüe em solução salina tamponada com fosfato (PBS) por 2 min.
    2. Autoclave a 120 °C por 10 min. Deixe esfriar naturalmente.
  6. Mergulhe em peróxido de hidrogênio a 1% em metanol por 10 min. Lave em PBS por 5 min.
  7. Adicione 500 μL de leite desnatado a 5% em PBS nas lâminas e incube-as por 30 min em temperatura ambiente.
  8. Colocar os 500 μL de anticorpo α-Syn antifosforilado (p-α-Syn, 1/10000) em PBS nas lâminas e incubá-los durante a noite a 4 °C. Lave 2x com PBS por 5 min cada.
  9. Incubar com polímero universal de imunoperoxidase, anti-Rabbit (Tabela de Materiais) por 1 h a 25 °C. Lave 2x com PBS por 5 min cada.
  10. Desenvolver utilizando o kit de coloração 3,3'-diaminobenzidina (DAB) (Tabela de Materiais) durante 5 min de acordo com as instruções do fabricante.
  11. Mergulhe em solução de hematoxilina por 1 min (Tabela de Materiais). Descolorir em água corrente por 10 min.
  12. Execute a montagem conforme descrito abaixo.
    1. Mergulhe em etanol 70% por 5 min. Mergulhe em etanol 100% por 2x por 5 min.
    2. Mergulhe em xileno 100% por 2x por 5 min. Monte usando um meio de incorporação (Tabela de Materiais). Aplique os 100 μL de um meio de incorporação nas lâminas e cubra com uma lamínula de vidro.
  13. Adquira imagens usando um microscópio All-in-One com ampliação de 20x e 40x (Tabela de Materiais).

Resultados

A Figura 3 mostra vários exemplos de agregados α-Syn no OB. No presente estudo, administramos agregados de α-Syn na narina unilateral. As duas cavidades nasais são separadas pelo septo nasal, e cada OB projeta os neurônios sensoriais olfativos para cada cavidade nasal separadamente. Portanto, o OB no lado contralateral pode ser usado como controle.

A patologia P-α-Syn não foi observada no BO no lado tratado após 1 e 3 mese...

Discussão

Em estudo anterior, a administração de agregados de α-Syn na cavidade nasal de macacos induziu a morte de células dopaminérgicas e a deposição de ferro na substância negra, embora não tenham sido observados agregados de α-Syn21. A administração diária de agregados de α-Syn humano A53T na cavidade nasal de camundongos transgênicos α-Syn promotores de príons (camundongos M83) por 28 dias induziu patologia α-Syn no cérebro e sintomas motores em cam...

Divulgações

Os autores não têm conflitos de interesse a divulgar.

Agradecimentos

Todos os experimentos foram apoiados por Rie Hikawa. Agradecemos a Yasuko Matsuzawa pela papelada. Este estudo foi apoiado por JSPS KAKENHI (MS, No. JP19K23779, JP20K16493 e JP20H00663).

Materiais

NameCompanyCatalog NumberComments
All-in-One Fluorescence Microscope BZ-X710KEYENCEN/AAll-in-One microscope
Ampicillin Sodium SaltNacalai tesque02739-32
Bioruptor IISonicbioBR2006AWater bath type sonicator.
Butorphanol tartrateMeiji Seika PharmaWAK-52850
Cellulose tubeMISUMIUC20-32-100
DeepWellMaximizerTAITECMBR-022UPShaker
DynaCompetent Cells Zip BL21(DE3)BioDynamics Laboratory Inc.DS255Competent cell
EntellanSigma-Aldrich107961Rapid mounting medium for microscopy
Graefe Extra Fine Forceps Curved SerratedFST11152-10 forceps
Hardened Fine ScissorsFST14090-09scissors
Histofine Simple stain mouse MAX-PO (R)Nichirei Bioscience414341Universal Immuno-peroxidase Polymer, anti-Rabbit
ImageJ ver 1.52pNANAhttps://imagej.net/
innova4200New Brunswick scientific9105085Incubator shaker
Isopropyl-β-D-thiogalactopyranosideNacalai tesque19742-94
LB broth, LennoxNacalai tesque20066-24
Leica EG 1150 HLeica14 0388 86 108Modular Tissue Embedding Center
Leica TP 1020Leica14 0422 85108Automatic Tissue Processor 
MedetomidineFuji Film135-17473
Microm HM325 Rotary MicrotomeThermo Scientific902100
MidazolamMaruishi Seiyaku4987-211-76210-0
New hematoxylin Type GMuto65-9197-38Hematoxylin solution
Normal winged needle for vein D type, 25GTERUMONN2332R25G needle
Optima TLX UltracentrifugeBeckman Couler8043-30-1197Ultracentrifuge
P10 pipetteGilsonFA10002P
ParaffinLeica39601095
paraformaldehydeNacalai tesque30525-89-4
Peroxidase Stain DAB KitNacalai tesque25985-50
Pirece BCA Protein Assay KitsThermo Scientific23225BCA assay
pRK172Addgene#134504Plasmid
Q-Sepharose Fast Flow. cytiva17051001Ion exchange resin

Referências

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