Otimizando a coleta de lágrimas em camundongos para análise de mRNA e proteínas

Resumo

A identificação de biomarcadores de RNA e proteínas a partir de lágrimas em modelos de camundongos é uma grande promessa para o diagnóstico precoce em várias doenças. Este manuscrito fornece um protocolo abrangente para otimizar a eficácia e eficiência do isolamento de mRNA e proteína de lágrimas de camundongos.

Resumo

O filme lacrimal é um biofluido altamente dinâmico capaz de refletir alterações moleculares associadas à patologia, não apenas na superfície ocular, mas também em outros tecidos e órgãos. A análise molecular desse biofluido oferece uma maneira não invasiva de diagnosticar ou monitorar doenças, avaliar a eficácia do tratamento médico e identificar possíveis biomarcadores. Devido ao volume limitado de amostras, a coleta de amostras de lágrimas requer habilidades específicas e ferramentas apropriadas para garantir alta qualidade e máxima eficiência. Várias metodologias de amostragem de lágrimas foram descritas em estudos em humanos. Neste artigo, é apresentada uma descrição abrangente de um protocolo otimizado, especificamente adaptado para extrair informações de proteínas relacionadas à lágrima de modelos animais experimentais, especialmente camundongos. Este método inclui a estimulação farmacológica da produção de lágrimas em camundongos de 2 meses de idade, seguida da coleta de amostras usando tiras de Schirmer e a avaliação da eficácia e eficiência do protocolo por meio de procedimentos padrão, SDS-PAGE, qPCR e PCR digital (dPCR). Este protocolo pode ser facilmente adaptado para a investigação da assinatura da proteína lacrimal em uma variedade de paradigmas experimentais. Ao estabelecer um protocolo de amostragem de lágrimas acessível, padronizado e otimizado para modelos animais, o objetivo era preencher a lacuna entre a pesquisa em humanos e animais, facilitando estudos translacionais e acelerando os avanços no campo da pesquisa de doenças oculares e sistêmicas.

Introdução

As lágrimas são consideradas um ultrafiltrado plasmático e também foram descritas como um fluido intermediário entre o soro plasmático e o líquido cefalorraquidiano devido a uma sobreposição significativa nas biomoléculas que compartilham¹. Foi relatado que as lágrimas humanas contêm proteínas, lipídios lacrimais, metabólitos e eletrólitos². Recentemente, outras biomoléculas, como mRNAs, miRNAs e vesículas extracelulares, também foram identificadas 3,4,5,6,7.

Nos humanos, as lágrimas basais estão localizadas no filme lacrimal, que consiste em três camadas: a camada lipídica externa, que mantém a superfície da lágrima lisa para nos permitir ver através dela e evitar a evaporação da lágrima; a camada aquosa média, que mantém o olho hidratado, repele bactérias, protege a córnea e constitui 90% do filme lacrimal; e, finalmente, a camada de mucina, uma família de proteínas de alto peso molecular que estão em contato com a córnea e permitem que a lágrima adira ao olho⁸. A distribuição lacrimal pela superfície ocular começa com a secreção da glândula lacrimal. Esse fluido é então guiado através de dutos lacrimais para passar pela superfície do olho e fluir para os canais de drenagem. Cada piscar permite que as lágrimas se dispersem uniformemente por todo o olho, mantendo-o úmido⁹.

O filme lacrimal é um biofluido altamente dinâmico capaz de refletir alterações moleculares que ocorrem não apenas na superfície ocular, mas também em outros tecidos e órgãos. A análise da expressão diferencial nesse biofluido representa uma abordagem promissora para a descoberta de biomarcadores em doenças humanas ^10,11. A utilização do filme lacrimal como fonte de biomarcadores para o diagnóstico precoce em diversas patologias tem sido muito facilitada pela presença de métodos de coleta não invasivos. O método mais comum para coleta de lágrimas em clínicas humanas e veterinárias envolve o suporte baseado em membrana (tira de Schirmer), que opera com base no princípio da ação capilar, permitindo que a água nas lágrimas viaje ao longo do comprimento de uma tira de teste de papel ou tubos capilares colocados no saco conjuntival inferior do sujeito 12,13,14. Apesar da limitação inerente à obtenção de um pequeno volume de amostra por meio desse método, a análise bioquímica da composição da lágrima usando várias técnicas sensíveis facilitou a identificação de potenciais moléculas biomarcadoras^11,15. Protocolos para otimizar e avaliar a eluição de proteínas lacrimais de tiras e capilares de Schirmer em pacientes humanos estão bem documentados^16,17. No entanto, descrições completas de protocolos otimizados projetados especificamente para extrair informações moleculares relacionadas a lágrimas de modelos animais experimentais estão disponíveis, mas são escassas. Os métodos existentes, como a indução lacrimal por meio da estimulação direta da glândula lacrimal¹⁸, ao mesmo tempo em que permitem a coleta de volumes maiores, são invasivos e podem causar desconforto aos animais. Métodos não invasivos, como a coleta de lágrimas da superfície ocular, têm sido descritos como uma forma de isolar DNA e miRNAs^19,21.

Este protocolo visa estabelecer um método econômico e otimizado para coletar e processar lágrimas em camundongos. O método prioriza a não invasividade enquanto obtém volumes lacrimais suficientes adequados para análise molecular por meio de técnicas como SDS-PAGE, qPCR e dPCR. As informações extraídas de proteína e conteúdo de mRNA podem então ser utilizadas para identificar potenciais biomarcadores em modelos experimentais existentes de doenças.

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Protocolo

Todos os procedimentos aqui descritos foram aprovados pelo Comitê de Ética Animal da Cinvestav (CICUAL, # 0354/23). Os animais de laboratório foram tratados e manuseados em estrita conformidade com as diretrizes de uso de animais da revista e de acordo com a Declaração da Associação para Pesquisa em Visão e Oftalmologia (ARVO) para o Uso de Animais em Pesquisa Oftálmica e Visual. A saúde ocular antes e após os procedimentos foi avaliada por meio da avaliação de secreções oculares, pálpebras inchadas, anormalidades oculares e alterações de comportamento.

1. Animais e preparação de reagentes

1. Use três camundongos machos C57BL / 6 de 2 meses de idade por repetição para o procedimento, com um peso inicial de ~ 25 g (Figura 1). Processe cada mouse individualmente e coloque-o em uma almofada de aquecimento para manter o calor.
2. Para induzir a secreção lacrimal, prepare uma solução estoque de pilocarpina a 20 mg / mL usando água estéril.
3. Corte as tiras de teste de Schirmer em 5 mm de comprimento e dobre cada tira no entalhe em um ângulo de 90°.
4. Prepare 250 μL de água estéril com um inibidor de protease (1 comprimido para 50 mL, de acordo com as instruções do fabricante).

2. Estimulação e coleta da produção de lágrimas

1. Pese cada camundongo individualmente para calcular a dosagem apropriada de tratamentos.
2. Para estimular a produção lacrimal, administrar 30 mg/kg de pilocarpina por via intraperitoneal com uma seringa de insulina de 6 mm (Figura 1B). Aguarde 2 minutos após a injeção do medicamento para que seus efeitos se manifestem.
   NOTA: Os dados de animais não estimulados não puderam ser obtidos devido à disponibilidade limitada de fluido lacrimal.
3. Colete as lágrimas colocando a extremidade de cada fragmento de tira de Schirmer sobre o centro da pálpebra inferior com uma pinça e mantenha-a no lugar até que a lágrima atinja o limite da tira (Figura 1C). Em seguida, substitua a tira. Coloque sequencialmente 2 tiras de Schirmer em cada olho, com um intervalo de 2 minutos entre as tiras para coleta. O processo de coleta de lágrimas requer cerca de quatro fragmentos de tiras ao longo de 10 minutos por mouse.
4. Coloque os fragmentos da tira de Schirmer em tubos estéreis no gelo para evitar a degradação dos componentes. Assim que a coleta terminar, inicie o processamento de rasgos.

3. Isolamento de proteínas

1. Colocar os fragmentos da tira num tubo de microcentrífuga de 600 μL contendo 20 μL de água estéril com um inibidor de protease e centrifugar durante 1 h a 600 x g a 4 °C, como anteriormente indicado¹⁷ (Figura 1D).
2. Fazer uma punção com uma agulha injectora de aço inoxidável de 7,5 cm na ponta do tubo de 600 μL que contém a amostra (figura 1E). Em seguida, transferir esse tubo perfurado para um novo tubo esterilizado de 1,5 mL e centrifugar as amostras a 12.000 x g por 10 min a 4 °C, conforme relatado anteriormente¹⁷, para recuperar o volume de lágrimas diluídas. O volume do filme lacrimal (sobrenadante) estará no fundo do tubo.
3. Crie um pool de proteínas combinando o sobrenadante recuperado de todas as amostras. Neste experimento, foi obtido um volume total de aproximadamente 200 μL.
   NOTA: A produção de lágrimas pode durar mais de 1 hora. Durante esse tempo, as lágrimas ainda podem ser coletadas.
4. Quantifique o conteúdo total de proteína da poça lacrimal usando o método padrão de Bradford²².

4. Análise SDS-PAGE

1. Aqueça as amostras de proteína a 99 °C por 4 min para desnaturar as proteínas. Vortex as amostras brevemente para misturar os componentes.
2. Carregar 30 μg de teor de proteína quantificado de cada amostra num gel SDS-PAGE a 10% (Quadro 1) e executar as amostras a 90 V durante 2 h utilizando um método padrão²³.
3. Após a eletroforese, cubra o gel com solução de coloração (Tabela 1) e incube por 30 min para corar as proteínas.
4. Enxágue o gel com a solução de descoloração várias vezes até que o fundo fique claro e as faixas de proteína fiquem visíveis.
5. Adquira imagens com um sistema de documentação em gel.

5. Isolamento de mRNA para qPCR e PCR digital

1. Coloque as tiras em um tubo de microcentrífuga de 600 μL contendo 20 μL de água estéril. Faça uma punção na ponta do tubo contendo a amostra, coloque-a em um novo tubo esterilizado de 1,5 mL e centrifugue, conforme relatado anteriormente em lágrimas humanas³, por 20 min a 2.000 x g a 4 °C (Figura 1E-H).
2. Crie um pool de todos os exemplos. O volume recuperado deste experimento foi de aproximadamente 22 μL de sobrenadante para cada camundongo, ou seja, 66 μL de volume total. Coloque os tubos em gelo seco para evitar a degradação da biomolécula.
3. Adicionar 200 μL de solução monofásica de isotiocianato de fenol e guanidínio (obtido comercialmente) e homogeneizar por pipetagem. Deixe repousar por 5 min em temperatura ambiente. Nesta etapa, as amostras podem ser armazenadas a -20 °C por várias semanas ou a -70 °C por vários meses.
4. Adicione 40 μL de clorofórmio e misture em um vórtice por 15 s. Deixe repousar por 2 min em temperatura ambiente. Centrifugue a 10.000 x g por 15 min a 4°C.
5. Transfira cuidadosamente a fase aquosa (sem tomar a interfase) para um novo tubo de 1,5 ml.
6. Adicione 0,5 μL de glicogênio (0,05 μg/μL) a 100 μL de isopropanol e misture pipetando. O glicogênio é co-precipitado com o RNA e não interfere nas etapas subsequentes.
7. Deixe repousar por 10 min a -20 °C. Centrifugue a 10.000 x g por 10 min a 4 °C. Transvase rapidamente o sobrenadante.
8. Adicione 200 μL de etanol frio a 75% e ressuspenda o pellet de RNA por vórtice. Centrifugue a 8.000 x g por 5 min a 4 °C.
9. Transvase o etanol. Sem inverter o tubo, deixe secar ao ar por 20-30 min. Adicione 20 μL de água livre de RNase e ressuspenda.
10. Proceder à leitura da densidade óptica no espectrofotómetro de microvolume a 260 nm e 280 nm para avaliar a pureza do RNA. As amostras devem estar no gelo.
    NOTA: As bandas ribossômicas 28S e 18S não podem ser observadas usando um gel de agarose devido à natureza da amostra. A presença de outros RNAs, como miRNAs ou mRNAs, pode ser analisada por meio de um bioanalisador, como mostrado anteriormente¹⁸.
11. Sintetize o cDNA do RNA das lágrimas usando um kit comercial de acordo com o protocolo do fabricante.
    1. Comece com um RNA de entrada em uma faixa de 10 ng-5000 ng; de acordo com o kit utilizado, misture com 1 μL de Oligo (dT) e até 12 μL de água livre de RNase. Centrifugar a 500 x g durante 30 s e incubar a 65 °C durante 5 min.
    2. Adicione ao tubo de mistura 4 μL de tampão de reação 5x, 1 μL de inibidor de RNase, 2 μL de mistura dNTP e 1 μL de transcriptase reversa.
    3. Gire o tubo a 500 x g por 30 s para puxar a mistura para baixo. Em seguida, incubar o tubo a 42 °C durante 60 min. Termine a reação incubando o tubo a 70 °C por 10 min.
12. Devido à baixa concentração de mRNA nas lágrimas, recomenda-se o uso de cDNA não diluído para qPCR²⁴. Para este experimento, foram utilizados 150 ng de cDNA. Execute qPCR usando primers DNMT3a :
    Direto: GCCGAATTGTGTCTTGGTGGATGACA, Reverso: CCTGGTGGAATGCACTGCAGAAGGA e primers GAPDH :
    Avançar: ACTGGCATGGCCTTCCGTGTTCTTA, Reverso: TCAGTGTAGCCCAAGATGCCCTTC seguindo as instruções dos fabricantes e procedimentos do equipamento.
    1. Para o ciclo de qPCR, use o seguinte programa: Desnaturação inicial: 95 ° C por 10 min seguido por 45 ciclos de C 95 ° C - 15 s, 60 ° C - 30 s e 72 ° C - 30 s, terminando com uma extensão final a 72 ° C por 5 min.
    2. Realize uma análise da curva de fusão para avaliar a presença de dímeros de primer ou amplicons inespecíficos na reação. A rampa de temperatura começou de 50 °C a 99 °C finais, com uma retenção inicial de 90 s para a primeira etapa e uma retenção de 5 s entre cada etapa.
    3. Para dPCR²⁵, execute diluições seriadas para otimizar a quantidade de cDNA necessária para detectar o mRNA de interesse. Neste experimento, use as seguintes diluições de cDNA em água livre de nuclease: 150 ng, 75 ng, 37,5 ng e 18,75 ng de cDNA. Foram utilizados primers para DNMT3a mencionados anteriormente. Para o ciclo de dPCR, use o seguinte programa: desnaturação inicial: 95 °C por 2 min seguido por 40 ciclos de 95 °C - 15 s e 60 °C - 30 s.

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Resultados

O protocolo descrito neste artigo fornece um método fácil e acessível para obter informações moleculares do fluido lacrimal usando técnicas comumente disponíveis na maioria dos laboratórios de biologia molecular. Além disso, o protocolo pode ser ampliado empregando técnicas altamente sensíveis, como ELISA para detecção de atividade enzimática.

Após esses procedimentos, o rendimento total de proteína foi de aproximadamente 3-4 μg / μL. A análise da página SDS corada com Coom...

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Discussão

O fluido lacrimal é facilmente acessível, e a determinação de biomarcadores nas lágrimas pode ser empregada como uma técnica complementar bem-sucedida para o diagnóstico precoce de várias doenças humanas²⁷. Embora a análise bioquímica da composição da lágrima em modelos animais experimentais complemente essa abordagem e prometa um progresso significativo na compreensão da base molecular das doenças, há uma escassez de dados e protocolos disponíveis, o que nos levou a desenvolver ...

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Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
2-mercaptoethanol	Gibco	1985023
2x Laemmli buffer	Bio-Rad	16-0737
Acetic Acid	Quimica Meyer	64-19-7
Acrylamide	Sigma-Aldrich	A4058
Bradford Reagent	Sigma-Aldrich	B6916
Chloroform	Sigma-Aldrich	1003045143
Coomassie Blue R 250	US Biological	6104-59-2
Ethanol	Quimica Rique	64-17-5
GeneRuler 1kb plus DNA Ladder	Thermofisher scientific	SM1331
Glycerol	US Biological	G8145
Glycine	SANTA CRUZ	SC- 29096
Glycogen	Roche	10901393001
HCl	Quimica Rique	7647-01-0
Isopropyl alcohol	Quimica Rique	67-63-0
Methanol	Quimica Meyer	67-56-1
Micro tubes 1.5 ml	Axygen	MCT-150-C
Micro tubes 600 µl	Axygen	MCT-060-C
NaCl	Sigma-Aldrich	S3014
PCR tubes & strips	Novasbio	PCR 0104
Pilocarpine	Sigma-Aldrich	P6503-10g
Protease inhibitor	Roche	11873580001
QIAcuity EvaGreen PCR Kit (5mL)	Qiagen	250112
QIAcuity Nanoplate 26k 24-well (10)	Qiagen	250001
Real qPlus 2x Master Mix Green	Ampliqon	A323402
RevertAid First Strad cDNA Synthesis Kit	Thermofisher scientific	K1622
Schirmer's test strips	Laboratorio Santgar	SANT1553
SDS	Sigma-Aldrich	L3771
TEMED	Sigma aldrich	102560430
TRI reagent	Sigma-Aldrich	T9424-200ML	monophasic solution of phenol and guanidinium isothiocyanate
Tris	US Biological	T8650
Tris base	Chem Cruz	sc-3715A