Imagem molecular de organoides cerebrais humanos usando espectrometria de massa

Resumo

Um método avançado foi desenvolvido para imagens por espectrometria de massa (MSI) de organoides cerebrais que permite mapear distribuições de metabólitos dentro desses modelos. Essa tecnologia oferece insights sobre as vias metabólicas do cérebro e assinaturas de metabólitos durante o desenvolvimento inicial e na doença, prometendo uma compreensão mais profunda da função cerebral humana.

Resumo

Os modelos organoides cerebrais servem como uma ferramenta poderosa para estudar o desenvolvimento e a função do cérebro humano. A imagem por espectrometria de massa (MSI), uma tecnologia de ponta, nos permite mapear a distribuição espacial de diversas moléculas, como lipídios, açúcares, aminoácidos, drogas e seus metabólitos dentro desses organoides, tudo sem a necessidade de sondas moleculares específicas. Os dados MSI de alta qualidade dependem da preparação meticulosa da amostra. Os fixadores desempenham um papel fundamental, mas as opções convencionais, como glutaraldeído, paraformaldeído e criopreservação, como a sacarose, podem afetar inadvertidamente os metabólitos teciduais. A fixação ideal envolve congelamento instantâneo em nitrogênio líquido. No entanto, para pequenos organoides, uma abordagem mais adequada envolve a transição dos organoides diretamente da incubadora para uma solução de incorporação aquecida, seguida de congelamento em etanol seco resfriado a gelo. Outra etapa crítica é a incorporação antes da criossecção, que também requer materiais compatíveis com MSI, pois as opções tradicionais podem interferir na deposição e ionização da matriz. Aqui, é apresentado um protocolo otimizado para MALDI-MSI de alta resolução de organoides cerebrais humanos, abrangendo preparação de amostras, seccionamento e imagem usando espectrometria de massa. Este método mostra a distribuição molecular de pequenos metabólitos, como aminoácidos, com alta precisão e sensibilidade em massa. Como tal, juntamente com estudos complementares de organoides cerebrais, pode ajudar a iluminar processos complexos que regem o desenvolvimento inicial do cérebro, trajetórias metabólicas do destino celular e assinaturas distintas de metabólitos. Além disso, fornece informações sobre as localizações precisas das moléculas dentro do organoide, enriquecendo nossa compreensão da organização espacial dos modelos organoides cerebrais 3D. À medida que o campo continua avançando, espera-se um número crescente de estudos que utilizam o MSI para se aprofundar em organoides cerebrais e sistemas biológicos complexos, aprofundando assim a compreensão dos aspectos metabólicos da função e desenvolvimento do cérebro humano.

Introdução

Modelos organoides, derivados de células-tronco de tecido primário, células-tronco embrionárias ou células-tronco pluripotentes induzidas (iPSCs)^1,2,3 avançaram na pesquisa em biologia humana, oferecendo modelos tridimensionais que imitam de perto funções específicas de órgãos, auxiliando no estudo do desenvolvimento humano, mecanismos de doenças e descoberta de^{medicamentos4,5}. Nesse contexto, desvendar as complexidades dos organoides cerebrais é fundamental para a compreensão do desenvolvimento fisiológico e patológico do cérebro ^6,7, necessitando de tecnologias como imagens por espectrometria de massa (MSI)^8,9. O MSI, distinto da espectrometria de massa tradicional, permite o mapeamento direto e sem marcação de centenas a milhares de biomoléculas em uma única seção de tecido, fornecendo informações detalhadas sobre a distribuição espacial de moléculas - como lipídios, peptídeos, aminoácidos, drogas e seus metabólitos - sem a necessidade de sondas moleculares específicas^10,11. Além disso, as imagens moleculares MSI podem ser co-registradas em seções histológicas e imunocoradas, fornecendo uma visão abrangente da morfologia do tecido, especificidade celular e conteúdo molecular.

O MSI é uma promessa significativa para a pesquisa de organoides, oferecendo insights sobre a base molecular das doenças, relações genético-fenótipos e respostas a estímulos ambientais 12,13,14,15. Na indústria farmacêutica, o MSI facilita as análises de absorção, distribuição, metabolismo e eliminação de fármacos em modelos pré-clínicos^11,16. Além disso, auxilia na resolução de seus metabólitos biotransformados, que podem ser farmacologicamente ativos¹⁷.

Entre os métodos MSI, predominam a dessorção/ionização a laser assistida por matriz (MALDI), a ionização por eletrospray de dessorção (DESI) e a espectrometria de massa de íons secundários (SIMS) 9,18,19,20,21. Destes, o MALDI-MSI se destaca por sua versatilidade, ampla faixa de massa, recursos de análise direta e compatibilidade com vários compostos químicos específicos do tecido²². No entanto, apesar de seu potencial, a aplicação do MALDI-MSI na pesquisa de organoides cerebrais permanece pouco explorada. Para resolver essa lacuna, um protocolo personalizado para análise de MALDI-MSI (HR-MALDI-MSI) de alta resolução de organoides cerebrais foi introduzido para otimizar a preservação do tecido, a seleção da matriz e as condições de imagem, garantindo a aquisição confiável de dados de alta qualidade¹⁵. Este protocolo detalhado mostra as capacidades do HR-MALDI-MSI para fornecer aos pesquisadores o arsenal adicional para aproveitar o poder dessa tecnologia para explorar a paisagem metabólica dos organoides com detalhes sem precedentes.

Protocolo

O estouro geral do protocolo é representado na Figura 1. Os detalhes dos reagentes e do equipamento utilizado no estudo estão listados na Tabela de Materiais.

1. Preparação da seção organoide cerebral

1. Prepare organoides cerebrais (2-3 mm de tamanho quando atingem 30-60 dias em cultura) a partir de células-tronco pluripotentes induzidas (iPSC) seguindo relatórios publicados anteriormente^23,24 e colete-os no momento desejado usando pontas largas.
   1. Lave os organoides preparados três vezes com 1x solução salina tamponada com fosfato de Dulbecco (DPBS) sem CaCl₂ e MgCl₂ em temperatura ambiente para enxaguar o meio e, em seguida, muito rapidamente com água destilada em temperatura ambiente para enxaguar quaisquer sais do DPBS.
2. Prepare 10% da solução de gelatina a partir da pele fria do peixe, mexendo e aquecendo a gelatina (10 mg em 100 mL de DPBS) a 70-80 °C por 2 h, depois mova a solução para a incubadora a 37 °C por 30 min para remover as bolhas e equilibrar a temperatura da incubadora onde os organoides foram cultivados.
   NOTA: Recomenda-se preparar gelatina fresca para cada experimento, mas ela pode ser usada por até 1 semana (armazenar a 4 ° C), se necessário. A gelatina solidifica à temperatura ambiente e precisa ser aquecida antes de ser usada como solução de incorporação para se tornar líquida.
3. Prenda o organoide no centro de um molde de plástico (25 mm x 20 mm x 5 mm) com a ponta da pipeta pequena e despeje delicadamente a solução de incorporação de gelatina a 10% no molde até que o organoide esteja totalmente imerso (o molde deve estar aproximadamente cheio até a metade).
   1. Coloque o molde em uma placa de Petri em gelo seco contendo 100% de etanol frio para congelá-lo rapidamente (1-2 min). Quando completamente congelado, evidenciado pela mudança de cor para branco sólido, retire o bloco de gelatina organoide da placa de Petri, embrulhe-o em papel alumínio ou coloque-o em um copo de lata, lacrado para evitar a concentração de água, e armazene a -80 ° C até que esteja pronto para a criossecção.
4. Para criosecção, coloque os blocos de plástico contendo organoides dentro da câmara criogênica a -20 °C a -25 °C por 10-15 min para equilibrar com a temperatura da câmara. Secione os organoides em seções de 14 μm usando criotômico e montagem de descongelamento em lâminas de vidro revestidas com óxido de índio e estanho (lâminas ITO) para MSI.
5. Digitalize imediatamente seções estruturalmente uniformes no espectrômetro de massa ou sele-as no recipiente e armazene-as a -80 ° C para estudos posteriores.

2. Preparação da matriz e aplicação para MALDI-MSI

1. Para MALDI-MSI, pulverize as lâminas e cubra as seções de tecido com a matriz, um composto orgânico que ajuda a ionizar diferentes metabólitos²⁵. Diferentes matrizes são usadas para obter imagens de diferentes espécies de moléculas; portanto, primeiramente, deve-se escolher a matriz mais adequada para o estudo.
   NOTA: Este estudo se concentrou na localização e distribuição de pequenos metabólitos e aminoácidos relacionados às vias metabólicas mitocondriais, e a matriz foi escolhida de acordo (para mapeamento de lipídios, consulte Cappuccio et al.)¹⁵.
2. Primeiro, ao retirar as lâminas ITO de -80 °C, coloque a lâmina imediatamente em um dessecador por 20 min para minimizar a condensação da água atmosférica nas superfícies.
3. Preparar dicloridrato de N-(1-naftil)etilenodiamina (NEDC), que é uma matriz adequada para pequenos metabolitos, uma vez que dá um sinal forte da substância a analisar de interesse sem interferir com os sinais de fundo sob o m/z de 500 Da²⁶. Pulverize 10 mg / mL de solução NEDC em metanol a 70% nas seções organoides após a dessecação da lâmina usando um pulverizador pneumático aquecido.
4. Defina os parâmetros do pulverizador de matriz da seguinte forma: temperatura do bico = 75 °C, velocidade do bico = 1,250 mm/min, vazão da bomba = 100 μL/min, número de passadas = 8, espaçamento da trilha = 2.5 mm, vazão de gás 3L/min, tempo de secagem =10 s e pressão de gás nitrogênio de 10 psi.

3. Instrumentação MALDI-MSI

1. Para obter uma plataforma MALDI-MSI de alta resolução para visualizar metabólitos organoides cerebrais, monte uma fonte de íons MALDI com uma interface de funil de íons duplos em um espectrômetro de massa.
2. Use um laser Nd conectado com chave Q e frequência triplicada com comprimento de onda de 349 nm, taxa de repetição de 1 kHz e energia de pulso de aproximadamente 1.3-1.4 μJ.
3. Para evitar a sobreamostragem, focalize o laser em um tamanho de ponto de ~15 μm de diâmetro.
4. Anexar a amostra ao injector MALDI stage. Opere e mantenha o funil de íons de alta pressão em 7,4-7,5 Torr e mantenha o funil de íons de baixa pressão em 1,6-1,8 Torr.
5. Aplique tensões de radiofrequência de 604 kHz, 80 V0 de pico e 780 kHz, 191 V0 de pico aos funis de íons de alta e baixa pressão, respectivamente.
6. Para melhorar a sensibilidade para pequenos metabólitos na faixa de baixa massa, reduza as amplitudes de RF no funil de baixa e alta pressão da fonte MALDI-MSI para aproximadamente 20% e 15%, respectivamente.
7. Defina a resolução em massa para 70.000. Selecione a área e o tamanho do pixel (25 μm/pixel) a serem medidos no software injetor MALDI.

4. Aquisição e análise de dados MALDI-MSI

1. Adquira dados na faixa m/z de 80-900 nos modos de íons negativos e positivos. Digitalizar as amostras com uma resolução lateral de 25 μm por pixel para secções organoides de 14 μm.
2. Defina o tempo de injeção de íons no espectrômetro de massa em 250 ms e adquira os espectros de massa da transformada de Fourier (FTMS) no modo de perfil enquanto o controle automático de ganho (AGC) está desligado²⁶.
3. Use os picos da matriz NEDC como uma calibração de massa on-line interna, resultando em uma precisão de massa superior a ±5 ppm.
4. Use software compatível para processar os dados. Importe os dados espectrais MSI diretamente para o software e, em seguida, execute a correção da linha de base usando um algoritmo de convolução e normalize os dados usando a contagem total de íons (TIC).
5. Gere a lista de recursos de imagens de íons a partir dos arquivos de dados brutos usando uma largura de compartimento de Δm/z = 0,01 ou ±5 ppm para distinguir imagens m/z com base no defeito de massa e na cobertura de pixels.
6. Gere imagens em cores falsas (Jet) ou RGB (vermelho-verde e azul) a partir de espécies individuais de íons metabólitos. Carregue a lista m/z de arquivos de dados brutos obtidos do MALDI-MSI para o Banco de Dados de Metaboloma Humano (HMDB) (tolerância de massa <5 ppm em relação ao m/z teórico) para identificar metabólitos.
   NOTA: A massa exata e a fórmula e estrutura previstas do metabólito obtidas a partir dos dados de LC-MS/MS também são usadas para consultar bancos de dados metabolômicos (por exemplo, HMDB, Metlin) para comparação e identificação de metabólitos.

Resultados

Aqui está um protocolo que otimiza a imagem molecular (metabólica) usando MSI (Figura 1, consulte também Cappuccio et al.)¹⁵. Os dados mais confiáveis e a preservação da morfologia do tecido foram obtidos com gelatina a 10% de pele fria de peixe, conforme confirmado pela coloração histológica de cortes seriados. Usando a incorporação de gelatina de peixe de organoides cerebrais humanos de 60 dias, os metabólitos relacionados ao ciclo de Krebs foram mapeados usando MSI, demonstrando sua distribuição espacial (Figura 2).

No geral, o protocolo otimizado forneceu consistentemente resultados robustos, com 10% de gelatina de pele de peixe fria como o material de incorporação preferido e configurações de spray de matriz NEDC ajustadas para melhorar a resolução da imagem. Os pequenos metabólitos detectados nos organoides cerebrais fornecem informações valiosas sobre as complexidades moleculares desse tecido.

Figura 1: Pipeline geral do estudo do metaboloma organoide do cérebro humano. Organoides derivados de fibroblastos individuais por meio de células-tronco pluripotentes induzidas são usados para LC-MS e MSI para destacar a distribuição espacial de metabólitos. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 2: Mapeamento de metabólitos relacionados ao ciclo de Krebs. Identificação e distribuição de metabólitos relacionados ao ciclo de Krebs usando organoides de 60 dias derivados de controles saudáveis usando MSI. A coloração de hematoxilina e eosina é mostrada. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Discussão

O protocolo refinado para MALDI-MSI de alta resolução de organoides cerebrais humanos aborda meticulosamente etapas essenciais para garantir a confiabilidade dos resultados. A preservação da amostra emerge como primordial e, para contornar rachaduras e danos aos tecidos, um método alternativo de congelamento é proposto envolvendo uma solução de inclusão aquecida e etanol resfriado com gelo seco. Este protocolo funciona melhor para tecidos de tamanho minúsculo, como organoides cerebrais humanos¹⁵. Materiais de incorporação, como composto de temperatura de corte ideal (OCT) e inclusão de parafina fixada em formalina (FFPE), são advertidos devido à sua interferência na deposição e ionização da matriz. Em vez disso, a gelatina a 10% da pele fria do peixe é destacada como a solução ideal para incorporação, mostrando sua eficácia na preservação da integridade do tecido durante o crioseccionamento¹⁵. Além disso, a escolha da matriz e suas técnicas de deposição, como pulverização a seco, é imperativa para minimizar a deslocalização de pequenos metabólitos de baixo m/z e melhorar a resolução da imagem.

A robustez e a confiabilidade do protocolo são comprovadas pela detecção e visualização bem-sucedidas de um amplo espectro de moléculas em organoides cerebrais humanos¹⁵, produzindo informações valiosas sobre sua distribuição espacial e potencial significado biológico. Essas descobertas aumentam significativamente a compreensão da intrincada paisagem molecular dentro dos organoides cerebrais, elucidando as principais vias de sinalização e processos metabólicos que sustentam o desenvolvimento e a função do cérebro.

Embora os dados atuais forneçam novos insights sobre a localização de diversas espécies, a fonte de imagem MALDI do espectroglifo usada neste estudo ainda não atingiu a resolução em nível de célula única (atualmente em ~ 10-20 μm). Outras plataformas, como o timsTOF da Bruker e o MRT da Water, podem fornecer resolução de célula única a 5 μm e, portanto, é importante ter em mente o instrumento a ser usado para experimentação.

Apesar dessas restrições, o HR-MALDI-MSI de alta resolução de organoides cerebrais é uma promessa considerável. A capacidade de mapear as distribuições de metabólitos e lipídios dentro dos organoides oferece um ponto único nas trajetórias metabólicas do destino celular, vias e assinaturas distintas cruciais para o desenvolvimento e maturação dos organoides. Essa metodologia serve como uma ponte entre a histologia convencional e a análise molecular, facilitando uma compreensão mais profunda das interconexões entre genoma, fenômeno e respostas ambientais.

Em resumo, o protocolo otimizado para HR-MALDI-MSI de organoides cerebrais humanos constitui um ativo valioso para pesquisadores que exploram modelos organoides. Este método estabelece as bases para uma maior elucidação das complexidades moleculares que sustentam o desenvolvimento e a função do cérebro, abordando meticulosamente as etapas críticas, a solução de problemas e o reconhecimento das limitações. À medida que a tecnologia MSI evolui e se torna cada vez mais acessível, ela está pronta para avançar nossa compreensão do desenvolvimento humano inicial, modelagem de doenças e descoberta de medicamentos.

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
(1S, 2S)-1,2-di-1-Naphthyl-ethylenediamine dihydrochloride	Sigma-Aldrich (St. Louis, MIA)	1052707-27-3	Matrix substance for MALDI-MS, ≥99.0% (HPLC)
1× Dulbecco’s phosphate-buffered saline (DPBS)	Life Technologies, USA	14190-144	Without CaCl2 and MgCl2
ART Wide Bore Filtered Pipette Tips	Thermo Fisher Scientific, Massachusetts, USA	2069G	Reduce potential contamination
Cryomolds	Tissue-Tek	25608-916	Standard mold with flat-surface
Entellan	Fisher Scientific	M1079610500	Cover slips
Eosin Y	Fisher Scientific (Waltham, MA, USA)	E511-25	Certified Biological Stain
Fish gelatin	Sigma-Aldrich (St. Louis, MIA)	G7041	Powder form from cold water fish skin
Hematoxylin	Fisher Scientific (Waltham, MA, USA)	517-28-2	Certified biological stain Elevated pressure imaging source with
HTX M5+ sprayer	HTX Technologies LLC, Carrboro, USA		Matrix sprayer
Indium tin	Hudson Surface Technology,	PL-IF-000010-P25	Provide a conductive surface for MALDI imaging
MALDI ion source	Spectroglyph LLC, USA		dual ion funnel interface
Methanol	Fisher Scientific (Waltham, MA, USA)	67-56-1	HPLC grade
oxide (ITO) conductive–coated slides	New York, United States
Porcine gelatin	Sigma-Aldrich (St. Louis, MIA)	G1890	Powder form from porcine skin
Q-Exactive mass spectrometer	Thermo Fisher Scientific, Massachusetts, USA		High resolution mass spectrometry
SCiLS Lab software	version 2024a Pro		for processing the data
Water	Fisher Scientific (Waltham, MA, USA)	W6500	HPLC grade
	(Waltham, MA, USA)