Detecção eficaz de células da população do lado de Hoechst por citometria de fluxo

Resumo

Aqui, mostramos que os lasers de alta potência de 375 nm e 405 nm podem efetivamente excitar o Hoechst 33342 e servir como uma alternativa viável ao laser de 355 nm para detecção de células da população lateral (SP), expandindo assim a gama de lasers disponíveis em aplicações de citometria de fluxo.

Resumo

As células da população lateral (SP) são identificadas por meio da coloração Hoechst 33342 e analisadas por citometria de fluxo (FCM). O método Hoechst SP é utilizado para o isolamento de células-tronco com base nas propriedades de efluxo de corante de transportadores de de ligação de ATP (ABC). O método foi inicialmente empregado para a identificação e isolamento de células-tronco hematopoiéticas (HSCs), mas agora evoluiu para se concentrar principalmente na identificação e isolamento de células-tronco cancerígenas (CSCs). O método tradicional de detecção de FCM usa um laser de 355 nm para excitar o corante para detectar células SP. Por meio deste estudo, identificamos com sucesso abordagens alternativas para excitação de corante que podem efetivamente substituir a detecção de células SP usando um laser de 355 nm. Isso é conseguido através da utilização de lasers de alta potência de 375 nm ou 405 nm. Isso nos permite exercer seletividade aprimorada na detecção de células SP, em vez de nos limitarmos apenas à citometria de fluxo a laser de 355 nm.

Introdução

As células da população lateral (SP) são identificadas por meio da coloração Hoechst 33342 e analisadas por citometria de fluxo (FCM). As células SP são caracterizadas pelo bombeamento do corante de DNA fluorescente para fora das células através de seu transportador de de ligação a ATP (ABC) ^1,2. O método foi originalmente estabelecido para isolar células-tronco hematopoiéticas (HSCs^{) da} medula óssea murina1. As células SP da medula óssea foram enriquecidas com uma população de HSCs caracterizada por^baixa expressão de CD117⁺Sca-1^{+Lin-Thy1 3,4}. Depois disso, o método foi amplamente utilizado para isolar e enriquecer células-tronco de outros tecidos, incluindo músculo cardíaco⁵, fígado⁶, pulmão⁷, rim⁸ e prosencéfalo⁹. Em particular, o método foi aplicado para isolar células-tronco cancerígenas (CSCs) na última década. As CSCs representam uma pequena população de células que possuem as propriedades de iniciação tumoral, auto-renovação, resistência à quimioterapia e potencial metastático¹⁰. As CSCs foram inicialmente identificadas em neoplasias hematopoiéticas¹¹ e posteriormente observadas em vários tumores sólidos, como carcinomas de próstata¹², ovário¹³, gástrico¹⁴, mama¹⁵ e pulmão¹⁶. Apesar da disponibilidade de várias técnicas para identificação de CSC, a técnica SP continua sendo uma escolha preferida devido à sua ampla aplicabilidade em diversos tecidos e linhagens celulares. Além disso, é uma técnica valiosa que isola CSCs usando classificação de células ativadas por fluorescência (FACS)16,17,18. Os achados experimentais demonstram que as células SP exibem tumorigenicidade pronunciada e exibem níveis elevados de expressão de genes associados a células-tronco^19,20. Nosso estudo anterior²¹ também demonstrou que a análise transcriptômica de células SP isoladas no mieloma múltiplo revela enriquecimento das vias de sinalização associadas às células-tronco, como a via hedgehog. Enquanto isso, realizamos análises de enriquecimento de vias nos genes diferencialmente expressos nas células SP da leucemia mielóide aguda²². Os genes alterados foram enriquecidos em vias relacionadas a células-tronco (Wnt/β-catenina, TGF-β, Hedgehog, Notch). Descobrimos que 1 x 10⁵ células SP poderiam formar tumores em camundongos BALB/c nulos²², enquanto as células não-SP não podiam, indicando que as células SP tinham características de células-tronco de leucemia. A eficácia do método Hoechst SP na identificação de CSCs é evidente.

O protocolo Hoechst SP foi refinado e aprimorado através da progressão da pesquisa. O protocolo envolve um controle rigoroso da concentração do corante, densidade celular, temperatura e duração da incubação, composição do tampão e valor do pH. As amostras de células preparadas de acordo com este protocolo foram submetidas à análise por citometria de fluxo. Devido à excitação do corante Hoechst com um laser UV a 355 nm e à detecção de sua emissão de fluorescência usando um filtro de 690/50 nm (Hoechst Red) e um filtro de 450/50 nm (Hoechst Blue), um laser de 350 nm é necessário para FCM. No entanto, os lasers de 350 nm não são comumente equipados na maioria dos FCMs devido ao seu alto custo. Assim, tentamos encontrar uma abordagem alternativa para a excitação do corante para a detecção efetiva de células SP por citometria de fluxo. Neste estudo, a capacidade dos lasers de 375 nm e 405 nm na detecção de células SP foi avaliada e comparada com a do laser de 355 nm. Nossos achados demonstram uma notável semelhança entre as células SP detectadas pelos lasers de 355 nm, 375 nm e 405 nm. Esses resultados sugerem que os lasers de alta potência de 375 nm e 405 nm podem servir como alternativas viáveis ao laser de 355 nm para detecção de células SP. A inclusão de fontes de luz de excitação adicionais para Hoechst 33342 facilita o uso de mais modelos de citometria de fluxo.

Protocolo

Os experimentos neste estudo utilizaram um total de 10 camundongos C57BL/6 com idades entre 8 e 12 semanas. As operações experimentais foram conduzidas de acordo com um protocolo aprovado pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais da Universidade de Sichuan (#201609309). Os materiais experimentais e os parâmetros de citometria de fluxo usados neste artigo estão listados na Tabela de Materiais.

1. Isolamento e coleta de células da medula óssea de camundongos

1. Eutanásia de camundongos em estrita conformidade com as diretrizes institucionais. Para induzir a inconsciência no camundongo, administre anestésicos inalatórios começando com isoflurano a 2%, seguido por um aumento gradual na dose para isoflurano a 5% até a cessação da respiração.
2. Disseque os ratos na sala cirúrgica ou no armário de exaustão. Limpe e esterilize os camundongos com etanol 70%.
3. Corte completamente a pele e o músculo da perna com uma tesoura afiada e disseque os fêmures.
4. Esmague o fêmur suavemente com uma haste de moagem em um pilão e lave as células da medula óssea com meio DMEM até que o osso fique branco.
5. Filtrar as células da medula óssea obtidas com um filtro de 100 μm para tubos de 15 ml. Centrifugue a 800 x g por 5 min a 4 °C.
6. Descarte o sobrenadante e lise os glóbulos vermelhos residuais com 1 mL de tampão de lise de glóbulos vermelhos por 1 min a 4 ° C. Centrifugue a 800 x g por 5 min a 4 °C. Após centrifugação, lave novamente com meio DMEM.
7. Ressuspenda as células em 2 mL de solução de incubação (meio DMEM + 5% FBS), conte as células com um contador automático de células e ajuste a concentração celular para 1,0 x 10⁶ células/mL com solução de incubação.

2. Coloração celular

1. Suplementar 2 ml de suspensão de células da medula óssea de cada ratinho com 5 μg/ml de Hoechst 33342. A outra alíquota de 1 ml, adicionar 100 μM de verapamil como controlo negativo.
2. Incubar em banho-maria a 37 °C durante 90 min com agitação suave de 30 em 30 min.
3. Após a incubação, arrefecer as células em gelo durante 5 min e centrifugar a 250 x g durante 5 min a 4 °C. Ressuspenda as células em uma solução de funcionamento a frio (HBSS + 2% FBS). Centrifugar a 4 °C durante 5 min e rejeitar o sobrenadante.
4. Ressuspenda o grânulo celular resultante em 500 μL de solução corrente por amostra. Antes da análise FCM, suplemente as células com 2 μg/mL de iodeto de propídio (PI) e coloque no gelo por aproximadamente 5 min.

3. Citometria de fluxo

NOTA: Para obter um resumo dos vários sistemas e configurações usados, consulte a Tabela 1.

1. Calibre os valores do coeficiente de variação (CV) dos canais necessários usando fluoroesferas de controle de qualidade (CQ) diárias nos FCMs e realize testes de amostra após a conclusão bem-sucedida do controle de qualidade.
   1. Selecione o atalho da área de trabalho do software e inicie o software.
   2. Selecione Iniciar CQ/Padronização no menu CQ/Padronização para acessar o experimento de CQ.
   3. Insira o tubo de amostra de fluoroesferas QC no suporte do tubo.
   4. Selecione Iniciar para carregar o exemplo e começar a executar o procedimento de controle de qualidade. Os FCMs estão prontos para uso após a aprovação do CQ.
2. Excite o corante Hoechst 33342 das mesmas amostras com um laser de 355 nm, 375 nm e 405 nm, respectivamente, para detecção de vermelho Hoechst no canal de 690/50 nm e azul Hoechst no canal de 450/50 nm.
   1. Crie um novo experimento selecionando Novo experimento no menu Arquivo, especifique o caminho do arquivo e salve o experimento.
   2. Selecione Definir canal no menu Configurações. Marque a caixa de seleção do sinal do canal (Y585, V450, V660, NUV450, NUV660, UV450, UV660) e adicione o nome do reagente na coluna Rótulo (Y585: PI; V450: Hoechst Blue-405 nm; V660: Hoechst vermelho-405 nm; NUV450: Hoechst Blue-375 nm; NUV660: Hoechst Blue-375 nm; UV450: Hoechst Azul-355nm; UV660: Hoechst Blue-355 nm).
   3. Clique nos ícones Pseudo Color Plots na área de plotagem para criar plotagens. Selecione um nome de eixo para alterar qual canal é exibido.
   4. Clique em Adicionar tubo na tela Tubo de ensaio para criar novos tubos de amostra e alterar seus nomes.
   5. Selecione Executar para carregar a amostra, exibir as plotagens e estabelecer as portas. Ajuste as configurações de ganho e limite. Selecione Gravar para salvar os dados.
3. Projete a lógica de configuração do portão.
   1. Para o primeiro gráfico, clique no eixo X para selecionar FSC-W e clique no eixo Y para selecionar FSC-A. Selecione Porta de polígono para desenhar a porta A para circundar a célula individual e excluir as células aderentes (Figura 1A).
   2. Para o segundo gráfico, clique no eixo X para selecionar FSC-A e clique no eixo Y para selecionar SSC-A. Selecione Porta de polígono para desenhar a porta B para separar células não fragmentárias e excluir detritos celulares (Figura 1B).
   3. Para o terceiro gráfico, clique no eixo X para selecionar PI-A e clique no eixo Y para selecionar SSC-A. Selecione a porta do polígono para desenhar a porta D. Selecione células vivas exibindo PI negativo (Figura 1C) e desenhe a porta C para obter células vivas.
   4. Para o quarto gráfico bidimensional, clique no eixo X para selecionar Hoechst Red e clique no eixo Y para selecionar Hoechst Blue. Clique com o botão direito do mouse em Plotagem e selecione Propriedade no menu suspenso. Selecione Formato linear fou ambos os eixos X e Y. Selecione Porta de polígono para desenhar a porta SP para obter células SP (Figura 1D).
4. Para avaliar a elegibilidade da amostra, use 355 nm de um citômetro de fluxo específico²³ para detecção de células SP.
5. Use os lasers de 355 nm (potência do laser: 20 mW) e 405 nm (potência do laser: 80 mW) simultaneamente para detectar as células de controle (com adição de verapamil) e as células experimentais.
6. Adquira sinais de fluorescência nos canais de 690/50 nm e 450/50 nm correspondentes aos dois lasers. Observe a estimulação efetiva do corante Hoechst 33342 por lasers de 355 nm e 405 nm com células SP transparentes ( Figura 2B-C ).
7. Para as mesmas amostras, use os lasers de 375 nm (potência do laser: 60 mW) e 405 nm (potência do laser: 80 mW) para detecção de células.

Resultados

Na Figura 2, o grupo controle foi tratado com verapamil, que bloqueia os transportadores ABC nas células-tronco para evitar a eliminação de Hoechst 33342. Assim, as células-tronco do grupo não-verapamil expelem Hoechst 33342 e formam uma população de células negativas conhecidas como células SP. O laser de 355 nm excitou efetivamente o corante Hoechst 33342, resultando em uma observação clara das células SP da medula óssea (Figura 2A). As células S...

Discussão

Usamos o protocolo descrito para realizar três experimentos, com cada tentativa envolvendo 3-4 camundongos, resultando em um total de 10 camundongos. A proporção de células SP variou de 0,05% a 0,76%. É importante notar que variações individuais foram observadas entre os camundongos. Utilizamos quatro citômetros de fluxo para analisar as amostras de Hoechst. Observa-se que a excitação do corante Hoechst por um laser de 20 mW de 355 nm na nova versão da citometria de fluxo é equivalente à de um laser de 100 m...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Automatic cell counter	Countstar	1M1200
Cell Filter(100 µm)	BIOFIL	CSS-013-100
Daily quality control fluorospheres	Beckman Coulter	B5230
Dulbecco's Modification of Eagle's Medium with 4.5g/L glucose (DMEM medium)	CORNING	10-013-CVRC
Fetal bovine serum	CORNING	35-081-CV
HBSS	Hyclone	SH30030.02
Hoechst 33342	Sigma-Aldrich	B2261
Propidium iodide (PI)	Sigma-Aldrich	P4170
Red blood cell lysis buffer	Beyotime	C3702
Verapamil	Sigma-Aldrich	V4629