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  • Discussão
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Resumo

Aqui, um método de cromatografia líquida de alta eficiência de fase normal é descrito para detectar e quantificar retinóides críticos envolvidos na facilitação da função visual no tecido ocular e sistêmico, no contexto do suprimento sistêmico de vitamina A para gerar o cromóforo de rodopsina fotossensível essencial 11-cis-retinal.

Resumo

Os receptores acoplados à proteína G (GPCRs) são uma superfamília de proteínas transmembranares que iniciam cascatas de sinalização por meio da ativação de sua proteína G após a associação com seu ligante. Em toda a visão de mamíferos, a rodopsina é o GPCR responsável pelo início da cascata de fototransdução. Dentro dos fotorreceptores, a rodopsina está ligada ao seu cromóforo 11-cis-retinal e é ativada através da isomerização sensível à luz de 11-cis-retinal para all-trans-retinal, que ativa a proteína G da transducina, resultando na cascata de fototransdução.

Embora a fototransdução seja bem compreendida, os processos envolvidos no fornecimento de precursores de vitamina A na dieta para a geração de 11-cis-retinal no olho, bem como doenças que resultam na interrupção desse fornecimento, ainda não são totalmente compreendidos. Uma vez que os precursores da vitamina A são absorvidos pelo intestino, eles são armazenados no fígado como ésteres de retinil e liberados na corrente sanguínea como all-trans-retinol ligado à proteína de ligação ao retinol 4 (RBP4). Este RBP4-retinol circulatório será absorvido por órgãos sistêmicos, como fígado, pulmões, rins e olhos. Portanto, um método para a quantificação dos vários metabólitos da vitamina A dietética no olho e nos órgãos sistêmicos é fundamental para o estudo da função adequada da rodopsina GPCR.

Neste método, apresentamos um método abrangente de extração e análise para análise de vitamina A em tecido murino. Por meio da análise de cromatografia líquida de alta eficiência em fase normal, todos os isômeros relevantes de retinaldeídos, retinóis e ésteres de retinil podem ser detectados simultaneamente por meio de uma única execução, o que permite o uso eficiente de amostras experimentais e aumenta a confiabilidade interna em diferentes metabólitos de vitamina A dentro da mesma amostra. Com este método abrangente, os investigadores poderão avaliar melhor o suprimento sistêmico de vitamina A na função GPCR da rodopsina.

Introdução

Os receptores acoplados à proteína G (GPCRs) são uma das superfamílias de proteínas mais estudadas e caracterizadas conhecidas. Em sua função mais conhecida, os GPCRs servem como um receptor de superfície celular na transdução de sinal, inicializando as respostas intracelulares ao se ligarem a um ligante específico. Os GPCRs são caracterizados por sete domínios helicoidais transmembrana (TM) e seis domínios de alça total. Das seis alças, três alças são orientadas extracelularmente para facilitar a ligação do ligante, enquanto as outras três alças intracelulares são acopladas a uma proteína G heterotrimérica que consiste nas subunidades Gα, Gβ e Gγ 1,2.

Os GPCRs são classificados em várias classes, incluindo Classe A Semelhante à Rodopsina, Família de Receptores de Secretina Classe B, Glutamato Classe C, Receptores de Feromônio de Acasalamento Fúngico Classe D, Receptores de AMP Cíclico Classe E e Classe F Frisado / Suavizado 3,4. Como o próprio nome sugere, a subclasse Classe A semelhante à rodopsina GPCR inclui a rodopsina, a GPCR crítica responsável pela fototransdução e função visual. A rodopsina contém todas as principais características e elementos estruturais pertinentes encontrados no modelo canônico de GPCRs, incluindo os sete domínios helicoidais da MT mencionados anteriormente, as seis alças extracelulares e intracelulares e a associação com uma proteína G heterotrimérica, também conhecida como transducina (Gt) em fotorreceptores 1,5,6,7. Dentro da bolsa de ligação da rodopsina, o 11-cis-retinal, o ligante cromóforo sensível à luz, liga-se à rodopsina na lisina 296 por meio de uma ligação covalente da base de Schiff, formando assim o 11-cis-retinilideno 1,8. Após a absorção de um fóton, o 11-cis-retinilideno fotoisomeriza em all-trans-retinilideno, induzindo uma mudança conformacional dentro da rodopsina. Portanto, o ligante 11-cis-retinal é crítico para a função do GPCR da rodopsina, e um suprimento robusto e eficiente de 11-cis-retinal deve ser mantido continuamente para superar a alta taxa de renovação dentro dos fotorreceptores.

Os retinaldeídos, como o 11-cis-retinal, pertencem a um grupo de moléculas chamadas coletivamente de retinóides, e os retinóides biologicamente relevantes são mais amplamente chamados de vitamina A. Os retinóides são caracterizados por um grupo final cíclico conectado a uma cadeia de polieno conjugada, com um grupo final polar na outra extremidade. Os retinaldeídos e os vitâmeros associados da vitamina A não são exceção a essa caracterização, que contêm o anel de β-ionona como o grupo final cíclico, uma cadeia de polieno diterpeno e um grupo final polar diferente dependendo do vitâmero, ou seja, grupo aldeído para retinaldeídos, grupo hidroxila para retinóis, grupo carboxila para ácidos retinóicos, ligação éster para ésteres de retinil, etc (Figura 1)9,10.

Os mamíferos não podem sintetizar vitamina A de novo, mas as plantas podem; Portanto, todos os retinóides dentro dos sistemas de mamíferos devem se originar da dieta de produtores à base de plantas para os consumidores da cadeia alimentar. No modelo canônico do metabolismo da vitamina A, o β-caroteno, a planta arquetípica da pró-vitamina A, é absorvido pelo enterócito intestinal através do receptor eliminador classe B, membro 1 (SCARB1), clivado em duas moléculas de all-trans-retinal pela β-caroteno oxigenase 1 (BCO1 / BCMO1), que se liga à proteína de ligação ao retinaldeído 2 (RBP2) e é reduzida a all-trans-retinol por retinol desidrogenases (RDH), convertido em ésteres de retinil pela lecitina retinol aciltransferase (LRAT) e, em seguida, enviado para a corrente sanguínea em quilomícrons 11,12,13,14. Os ésteres de retinila, como o palmitato de retinila, por outro lado, servem como a pró-vitamina A predominante de fontes animais. O palmitato de retinila do lúmen intestinal é hidrolisado em all-trans-retinol pela carboxilesterase 1 (CES1) e se difunde no enterócito intestinal15. O fígado é o principal órgão de armazenamento e homeostático da homeostase da vitamina A, que absorve os ésteres de retinilo dentro desses quilomícrons, que são hidrolisados em all-trans-retinol ligado à proteína de ligação ao retinol celular 1 (CRBP1) por hidrolases de éster de retinol, entra nas células estreladas hepáticas e é convertido novamente em ésteres de retinil por LRAT para armazenamento13,16, 17. Agosto Para manter um nível homeostático de vitamina A no organismo, o fígado libera vitamina A na forma de todo o trans-retinol ligado a um complexo de transporte sérico, consistindo na proteína de ligação ao retinol 4 (RBP4) e transtirretina (TTR) 15 , 18 , 19 . Este complexo será referido como holo-RBP4 neste manuscrito.

Para usar esse suprimento sistêmico de vitamina A no sangue, os tecidos sistêmicos, incluindo o tecido ocular, onde uma fonte robusta de vitamina A é mantida, devem ter um método para absorver o holo-RBP4 no tecido. Dentro da retina rica em fotorreceptores no tecido ocular, o receptor de membrana estimulado pelo ácido retinóico 6 (STRA6) é o transportador implicado nessa função. Em estudos mecanísticos, o STRA6 demonstrou ser capaz de facilitar a ingestão de all-trans-retinol extracelular do holo-RBP4 no RPE20. Este all-trans-retinol importado entrará então no ciclo visual, que é o processo pelo qual o all-trans-retinol é convertido em 11-cis-retinal dentro do EPR e do segmento externo do fotorreceptor, facilitando assim a função visual quando ligado à rodopsina 9,21.

Uma vez que o all-trans-retinol do holo-RBP4 circulatório atravessa a barreira sangue-retina para o EPR dentro do tecido ocular através do STRA6, o all-trans-retinol no RPE é primeiro esterificado em ésteres de retinil por LRAT, depois hidrolisado em 11-cis-retinol pela proteína de 65 kDa específica do epitélio pigmentar da retina (RPE65). O 11-cis-retinol é então convertido em 11-cis-retinal pela retinol desidrogenase 5. Este 11-cis-retinal é então transportado para o segmento externo do fotorreceptor (OS) pela proteína de ligação ao retinóide interfotorreceptor (IRBP) 9 , 21 . Dentro do retículo endoplasmático que envolve o núcleo do fotorreceptor dentro da camada nuclear externa (ONL), os GPCRs de opsina são sintetizados e transportados através do cílio de conexão (CC). As proteínas motoras envolvidas nesse transporte através do CC são controversas, mas as hipóteses atuais implicam o transporte intraflagelar (IFT) baseado em cinesina e dineína ou o transporte baseado em miosina como prováveis facilitadores desse processo 14,22,23,24,25,26. Uma vez que esses dois componentes se encontram dentro dos discos membranosos dentro do OS, 11-cis-retinal e opsina formam 11-cis-retinilideno através de uma ligação covalente de base de Schiff na lisina 196 na rodopsina, pronta para fototransdução8.

Embora a expressão de STRA6 no EPR da retina ajude a facilitar a ingestão de all-trans-retinol de holo-RBP4, STRA6 não foi encontrado expresso no fígado, apesar de seu papel como o principal órgão homeostático para vitamina A e exibindo capacidades na ingestão de all-trans-retinol de holo-RBP4 15,19,27,28, 29,30,31. Eventualmente, um receptor análogo chamado receptor 2 da proteína de ligação ao retinol 4 (RBPR2) foi descoberto, exibindo a capacidade de ingerir todo o trans-retinol do holo-RBP4, muito parecido com o STRA6, mas é expresso no tecido hepático32.

Portanto, uma compreensão completa do papel da rodopsina na função visual requer uma compreensão dos processos biológicos que culminam na regeneração do pigmento visual. Isso, por sua vez, está intimamente relacionado aos processos descritos anteriormente, incluindo o metabolismo de precursores de pró-vitamina A, armazenamento no fígado, liberação de holo-RBP4 pelo fígado e eventual captação de holo-RBP4 através dos receptores de membrana STRA6 e RBPR2. Como mencionado acima, modelos animais como camundongos continuam sendo um dos principais modelos no estudo de tais processos. Assim, gostaríamos de apresentar um método de extração de retinóides em tecido murino, bem como um método de cromatografia líquida de alta eficiência (HPLC) de fase normal que possa detectar e quantificar esses retinóides. Usando esses métodos, os retinóides importantes descritos acima, como o ligante de rodopsina 11-cis-retiniano ou o principal retinóide de transporte all-trans-retinol, podem ser analisados em órgãos oculares, hepáticos e sistêmicos. Ao avaliar o suprimento de retinóides no tecido murino, nossa compreensão dos estados de doença e patologias relacionadas ao suprimento logístico de retinóides pode ser ainda mais avançada.

Além de funcionar como um cromóforo na função visual por meio da associação com GPCRs de opsina, os retinóides também desempenham um papel importante na sinalização de células de mamíferos por meio da sinalização do ácido retinóico, facilitada por duas famílias de receptores nucleares, receptores de ácido retinóico (RARs) e receptores de retinóide X (RXRs), que se ligam diretamente ao DNA e regulam a transcrição gênica33. Essas duas famílias ou receptores utilizam retinóides na forma de ácidos retinóicos como ligante. Os RARs demonstraram ter afinidade tanto pelo ácido trans-retinóico quanto pelo ácido 9-cis-retinóico, enquanto os RXRs expressam afinidade apenas pelo ácido 9-cis-retinóico34,35. Os ácidos retinóicos em quantidades não controladas são teratogênicos e a sinalização do ácido retinóico deve ser extremamente rigidamente controlada36. A produção de ácidos retinóicos para sinalização deve ocorrer localmente e em momentos muito específicos para o desenvolvimento adequado dos tecidos, como no desenvolvimento do rombencéfalo e dos membros, mas inúmeros outros exemplos utilizam a sinalização do ácido retinóico37,38. Dentro das células que participam da sinalização do ácido retinóico, os ácidos retinóicos são sintetizados por dois grupos de enzimas, álcool/retinol desidrogenase (ADHs/RDHs) que facilitam a oxidação de retinóis absorvidos por STRA6 ou RBPR2 em retinaldeídos, e retinaldeído desidrogenase (RALDHs) que facilitam a oxidação de retinaldeídos em ácidosretinóicos 39. Embora não participem da sinalização GPCR per se, os ácidos retinóicos se apresentam como um retinóide crucial que também funciona como um ligante para receptores de sinalização.

Embora não seja descrito em detalhes aqui, gostaríamos de reconhecer os métodos previamente estabelecidos para detecção de retinóides usando HPLC em vários contextos, como na pesquisa de alimentos e no estudo da rodopsina microbiana. Esses métodos empregam diferentes objetivos e abordagens para a detecção de retinóides, incluindo o uso de técnicas de fase reversa que requerem fases móveis menos voláteis e perigosas 40,41,42, a detecção de ácidos retinóicos e seus isômeros associados 40,41 e purificação e extração de diferentes fontes biológicas43. Nosso método se concentra especificamente na detecção de palmitato de retinila, isômeros de retinaldeído e isômeros de retinol de tecidos de mamíferos. Diferentes protocolos devem ser considerados se o caso de uso pretendido for diferente dessa aplicação específica.

Protocolo

NOTA: Todos os experimentos com animais foram aprovados pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais (IACUC) da Universidade de Minnesota (protocolo # 2312-41637A) e realizados em conformidade com a Declaração ARVO para o Uso de Animais em Pesquisa Oftálmica e Visual. Realize todas as extrações no escuro, sob uma luz vermelha fraca para iluminação. Esteja ciente da luz residual emitida pelos visores de instrumentos e LEDs acessórios.

1. Geração de padrão de retinóide espectrofotométrico e geração de curva padrão externa

NOTA: Prepare um recipiente de gelo seco para armazenamento temporário de retinóides antes da análise com o HPLC.

  1. Pesar uma quantidade arbitrária mas adequada de retinóides e dissolvê-los num solvente adequado para quantificação por espectrofotometria.
    NOTA: O solvente de escolha usado neste estudo é o etanol, e os valores de absortividade molar dos retinóides dissolvidos em etanol estão detalhados na Tabela 1. Etanol anidro de grau HPLC deve ser usado para dissolver padrões e amostras. O etanol purificado exclusivamente por destilação forma uma mistura azeotrópica com água, contendo aproximadamente 4% de água em volume. A água é imiscível com a fase móvel hexanóica e resultará na hidratação da fase estacionária da sílica, levando a uma eventual degradação da coluna.
  2. Utilizando a Lei de Beer-Lambert e a absortividade molar do retinóide pertinente, quantificar a concentração do padrão gerado (Tabela 1).
    Absorbância = Absorvibilidade Molar (ε) × Concentração Molar × Comprimento do Caminho
  3. Realize diluições seriadas para criar concentrações que possam gerar uma curva padrão dentro da faixa de quantificação para o tecido desejado.
    NOTA: Esteja ciente das limitações fundamentais da Lei Beer-Lambert, como sua falta de validade com altas concentrações de analito. Para evitar esse problema, os padrões de retinóides diluídos devem evitar a geração de valores de absorbância maiores que 1. Para nossas aplicações em quantificação de retinol e retinaldeído em órgãos murinos, descobrimos que uma curva de calibração com faixa de 1 a 10 ng foi capaz de cobrir as quantidades típicas encontradas. Para a quantificação do palmitato de retinila do fígado murino, descobrimos que uma curva de calibração com uma faixa de 20-80 μg foi capaz de cobrir as quantidades típicas encontradas.
  4. Alterando incrementalmente o volume de injeção da solução estoque criada anteriormente, alterando assim incrementalmente a quantidade injetada de retinóide, integre os picos para gerar uma curva padrão externa adequada para quantificação de retinóides, onde a integração de picos é diretamente proporcional à quantidade de retinóide injetada.

2. Colheita de tecidos e coleta de amostras

NOTA: Prepare um recipiente de gelo seco para armazenamento temporário de tecido antes da homogeneização do tecido e extração de retinóide. As quantidades recomendadas de colheita de tecido estão detalhadas na Tabela 2. Para levar em conta as variações retinóides devido a variações no conteúdo sanguíneo de cada tecido, a extração de tecido deve ser feita em camundongos totalmente perfundidos e a extração de sangue deve ser concluída em camundongos separados.

  1. Eutanasiar os camundongos seguindo as diretrizes estabelecidas pelo protocolo ditado pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais (IACUC) (asfixia CO2 aqui).
  2. Sangue: Imediatamente após a eutanásia, decapite os camundongos com uma tesoura e drene o sangue do tronco principal dos camundongos para um tubo de 1,5 mL.
  3. Olho: Usando uma pinça, remova os olhos da cabeça decapitada.
  4. Cérebro: Usando uma tesoura pequena, corte a cabeça decapitada e remova o cérebro usando uma pinça.
  5. Rim, fígado, baço, coração e pulmão: Usando uma tesoura pequena, faça uma incisão no abdômen, corte na direção superior ao longo da linha média e corte o esterno e a caixa torácica. Remova o tecido exposto usando uma pinça.

3. Homogeneização de tecidos

NOTA: Se a análise de partições menores de órgãos for desejada, como em órgãos maiores (por exemplo, fígado ou tecido pulmonar), todo o órgão deve ser homogeneizado para evitar diferenças no conteúdo retinóide em diferentes partes do tecido. Em vez disso, divida o homogeneizado se forem desejadas quantidades menores de tecido. Um esquema para o protocolo é detalhado na Figura 2. Esse protocolo modificado foi adaptado de Kane e Napoli44.

  1. Coloque o lenço no tubo do moedor de tecidos, junto com 50% de solução salina gelada (0,9%) e 50% de metanol. Consulte a Tabela 2 para o volume usado para cada tipo de tecido.
  2. Coloque o pilão no tubo do moedor, lenta e suavemente execute cinco rotações completas com o pilão para obter um homogeneizado.
  3. Transfira as amostras para tubos de 15 mL imediatamente após a homogeneização.
  4. Adicione 2 mL de metanol e deixe descansar por 15 min em temperatura ambiente.
    NOTA: Se a análise de derivados de retinaldeído oxima for desejada, adicione 1 mL de cloridrato de hidroxilamina 0,1 M em HEPES 0,1 M (pH 6,5) (Figura 1).

4. Extração de retinóides

CUIDADO: O hexano é altamente inflamável, altamente volátil e altamente tóxico. Respiradores aprovados pelo Instituto Nacional de Segurança e Saúde Ocupacional (NIOSH), proteção para os olhos, luvas de butil e um exaustor devem ser usados ao manusear hexano. Ao evaporar o hexano das amostras, alguma forma de aparelho de circulação de ar aprimorado é recomendada para evitar o acúmulo de fumaça de solvente, por exemplo, um aparelho de sucção de snorkel.

  1. Adicionar 10 ml de hexano ao homogeneizado e misturar o tubo horizontalmente durante pelo menos 10 s.
    NOTA: É fundamental que as fases se misturem totalmente.
  2. Centrifugue a mistura homogeneizado/hexano durante 3 min a 1.000 × g para facilitar a separação de fases.
  3. Realize a extração 2x para garantir a extração total de retinóides do homogeneizado. Repita as etapas 4.1 e 4.2.
  4. Retire a camada de hexano usando uma pipeta e coloque a camada de hexano em um conjunto separado de tubos de vidro de 15 mL para evaporação a vácuo.
    NOTA: Para evaporação, use tubos de VIDRO de 15 mL para evitar a adesão de retinóides às paredes do tubo.
  5. Usando uma centrífuga a vácuo, evapore completamente o hexano.

5. Análise de ressuspensão e HPLC

NOTA: Como o sistema de HPLC usado neste manuscrito era um sistema de bomba binária, a fase móvel de quatro componentes foi pré-misturada em um único frasco antes da operação.

CUIDADO: Todos os quatro solventes orgânicos usados neste método são altamente inflamáveis, altamente voláteis e altamente tóxicos. O 1,4-dioxano é suscetível à formação de peróxido explosivo após a exposição ao oxigênio. Manter todos os recipientes que contenham 1,4-dioxano fechados quando não estiverem a ser utilizados. Respiradores aprovados pelo Instituto Nacional de Segurança e Saúde Ocupacional (NIOSH), proteção para os olhos, luvas de butilo e um exaustor devem ser usados ao manusear esses solventes. Ao executar esses solventes em uma HPLC, alguma forma de aparelho de circulação de ar aprimorado é recomendada para evitar o acúmulo de fumaça de solvente, por exemplo, um aparelho de sucção de snorkel.

  1. Ressuspenda o tubo seco de 15 mL com 100 μL de hexano; vórtice bem para garantir que todos os retinóides sejam dissolvidos.
  2. Pipetar todos os 100 μL de hexano num único inserto de vidro para análise por HPLC.
  3. Configurar a HPLC (adaptada de Landers e Olson45): fase móvel: 85,4% hexano (v/v), 11,2% acetato de etilo (v/v), 2% dioxano (v/v), 1,4% 1-octanol (v/v); coluna: duas colunas de 4,6 mm ID x 250 nm, 5 μm, conectadas em série; uma temperatura do termostato multicoluna: 25 °C; volume de injeção: 100 μL; vazão: 1 mL/min; Duração: 40 min. Use detecção de absorbância de espectro UV; manter a opção verificada para adquirir o espectro UV de 200 nm a 400 nm.

6. Identificação e integração de picos

  1. Identifique os picos usando o tempo de retenção e os espectros UV de cada retinóide de interesse, conforme observado na análise dos padrões retinóides (Figura 3, Tabela 3 e Tabela 4).
  2. Utilizando o sistema de dados cromatográficos do sistema de HPLC escolhido, integrar os picos identificados. A integração, ou área sob a curva, é diretamente proporcional à quantidade de analito. Fazer referência à curva-padrão externa gerada na etapa 1 para quantificar a substância a analisar.
    1. Para análise de cromatogramas gerados a partir de tecido biológico, use a integração manual em vez da integração automática oferecida por sistemas de dados cromatográficos típicos, uma vez que variabilidades em parâmetros como o tempo de retenção são frequentemente observadas em tais amostras.
    2. Certifique-se de que os cromatogramas não exibam irregularidades que possam indicar problemas durante a execução, como linhas de base ruidosas ou picos não gaussianos. Esses problemas indicam contaminantes na HPLC ou desgaste nas colunas e devem ser corrigidos para uma análise válida.

Resultados

Aqui, utilizamos o método descrito acima para detectar e quantificar retinóides em tecido ocular e sistêmico murino e geramos cromatogramas representativos. Além disso, daremos um resumo dos retinóides típicos que podem ser detectados nesses tecidos.

Aos 6 meses de idade, os camundongos foram eutanasiados por asfixia por CO2 . Para manter o conteúdo retinóide ocular, os camundongos foram adaptados ao escuro por 2 dias antes da eutanásia e e...

Discussão

Neste método, a HPLC de fase normal é usada para detectar e quantificar retinóides relevantes, incluindo ésteres de retinil, retinaldeídos e retinóis. Dada a importância do 11-cis-retinal como o cromóforo crítico na ativação do GPCR da rodopsina, um método que possa detectar os metabólitos relacionados à produção de 11-cis-retinal é fundamental para o estudo da função visual geral. A principal vantagem deste método é que todos os isômeros relevante...

Divulgações

Os autores declaram não haver conflito de interesses.

Agradecimentos

Este trabalho foi apoiado por bolsas NIH-NEI (EY030889 e 3R01EY030889-03S1) e em parte pelos fundos iniciais da Universidade de Minnesota para GPL Também gostaríamos de agradecer ao National Eye Institute por nos fornecer o padrão 11-cis-retinal usado neste manuscrito.

Materiais

NameCompanyCatalog NumberComments
Reagent
1-Octanol, suitable for HPLC, ≥99.5%Sigma-Aldrich, Millipore Sigma203-917-6
1,4-Dioxane, suitable for HPLC, ≥99.5%Sigma-Aldrich, Millipore Sigma204-661-8
11-cis-retinalNational Eye InstituteN/A
11-cis-RetinolToronto Research ChemicalsTRC-R252105
13-cis-retinalToronto Research ChemicalsTRC-R239900
13-cis-retinolToronto Research ChemicalsTRC-R252110
All-trans-RetinalToronto Research ChemicalsTRC-R240000
All-trans-RetinolToronto Research ChemicalsTRC-R252002
Ethyl Acetate, suitable for HPLC, ≥99.7%Sigma-Aldrich, Millipore Sigma205-500-4
Hexane, HPLC GradeFisher Scientific, Spectrum Chemical18-610-808
Methanol (HPLC)Fisher ScienctificA452SK-4
Retinyl PalmitateToronto Research ChemicalsTRC-R275450
Sodium Chloride (Crystalline/Certified ACS)Fisher ScientificS271-500
Instruments
1260 Infinity II Analytical Fraction CollectorAgilentG1364F
1260 Infinity II Binary PumpAgilentG7112B
1260 Infinity II Diode Array DetectorAgilentG7115A
1260 Infinity II Multicolumn ThermostatAgilentG7116A
1260 Infinity II VialsamplerAgilentG7129A
ST40R Refrigerated CentrifugeThermo ScientificTSST40R
Vacufuge Plus Centrifuge ConcentratorEppendorf22820168
Consumables
2 mL Amber Screw Top VialsAgilent5188-6535
Crimp Cap with PTFE/red rubber septa, 11 mmAgilent5183-4498
Disposable Glass Conical Centrifuge TubesMillipore SigmaCLS9950215
Screw cap tube, 15 mLSarstedt62.554.502
Vial insert, 150 µL, glass with polymer feetAgilent5183-2088

Referências

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