Análise quantitativa de metabólitos dietéticos de vitamina A em tecidos oculares e não oculares murinos usando cromatografia líquida de alta eficiência

Resumo

Aqui, um método de cromatografia líquida de alta eficiência de fase normal é descrito para detectar e quantificar retinóides críticos envolvidos na facilitação da função visual no tecido ocular e sistêmico, no contexto do suprimento sistêmico de vitamina A para gerar o cromóforo de rodopsina fotossensível essencial 11-cis-retinal.

Resumo

Os receptores acoplados à proteína G (GPCRs) são uma superfamília de proteínas transmembranares que iniciam cascatas de sinalização por meio da ativação de sua proteína G após a associação com seu ligante. Em toda a visão de mamíferos, a rodopsina é o GPCR responsável pelo início da cascata de fototransdução. Dentro dos fotorreceptores, a rodopsina está ligada ao seu cromóforo 11-cis-retinal e é ativada através da isomerização sensível à luz de 11-cis-retinal para all-trans-retinal, que ativa a proteína G da transducina, resultando na cascata de fototransdução.

Embora a fototransdução seja bem compreendida, os processos envolvidos no fornecimento de precursores de vitamina A na dieta para a geração de 11-cis-retinal no olho, bem como doenças que resultam na interrupção desse fornecimento, ainda não são totalmente compreendidos. Uma vez que os precursores da vitamina A são absorvidos pelo intestino, eles são armazenados no fígado como ésteres de retinil e liberados na corrente sanguínea como all-trans-retinol ligado à proteína de ligação ao retinol 4 (RBP4). Este RBP4-retinol circulatório será absorvido por órgãos sistêmicos, como fígado, pulmões, rins e olhos. Portanto, um método para a quantificação dos vários metabólitos da vitamina A dietética no olho e nos órgãos sistêmicos é fundamental para o estudo da função adequada da rodopsina GPCR.

Neste método, apresentamos um método abrangente de extração e análise para análise de vitamina A em tecido murino. Por meio da análise de cromatografia líquida de alta eficiência em fase normal, todos os isômeros relevantes de retinaldeídos, retinóis e ésteres de retinil podem ser detectados simultaneamente por meio de uma única execução, o que permite o uso eficiente de amostras experimentais e aumenta a confiabilidade interna em diferentes metabólitos de vitamina A dentro da mesma amostra. Com este método abrangente, os investigadores poderão avaliar melhor o suprimento sistêmico de vitamina A na função GPCR da rodopsina.

Introdução

Os receptores acoplados à proteína G (GPCRs) são uma das superfamílias de proteínas mais estudadas e caracterizadas conhecidas. Em sua função mais conhecida, os GPCRs servem como um receptor de superfície celular na transdução de sinal, inicializando as respostas intracelulares ao se ligarem a um ligante específico. Os GPCRs são caracterizados por sete domínios helicoidais transmembrana (TM) e seis domínios de alça total. Das seis alças, três alças são orientadas extracelularmente para facilitar a ligação do ligante, enquanto as outras três alças intracelulares são acopladas a uma proteína G heterotrimérica que consiste nas subunidade....

Protocolo

NOTA: Todos os experimentos com animais foram aprovados pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais (IACUC) da Universidade de Minnesota (protocolo # 2312-41637A) e realizados em conformidade com a Declaração ARVO para o Uso de Animais em Pesquisa Oftálmica e Visual. Realize todas as extrações no escuro, sob uma luz vermelha fraca para iluminação. Esteja ciente da luz residual emitida pelos visores de instrumentos e LEDs acessórios.

1. Geração de padrão de retinóide espectrofotométrico e geração de curva padrão externa

NOTA: Prepare um recipiente de gelo....

Discussão

Neste método, a HPLC de fase normal é usada para detectar e quantificar retinóides relevantes, incluindo ésteres de retinil, retinaldeídos e retinóis. Dada a importância do 11-cis-retinal como o cromóforo crítico na ativação do GPCR da rodopsina, um método que possa detectar os metabólitos relacionados à produção de 11-cis-retinal é fundamental para o estudo da função visual geral. A principal vantagem deste método é que todos os isômeros relevante.......

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Reagent
1-Octanol, suitable for HPLC, ≥99.5%	Sigma-Aldrich, Millipore Sigma	203-917-6
1,4-Dioxane, suitable for HPLC, ≥99.5%	Sigma-Aldrich, Millipore Sigma	204-661-8
11-cis-retinal	National Eye Institute	N/A
11-cis-Retinol	Toronto Research Chemicals	TRC-R252105
13-cis-retinal	Toronto Research Chemicals	TRC-R239900
13-cis-retinol	Toronto Research Chemicals	TRC-R252110
All-trans-Retinal	Toronto Research Chemicals	TRC-R240000
All-trans-Retinol	Toronto Research Chemicals	TRC-R252002
Ethyl Acetate, suitable for HPLC, ≥99.7%	Sigma-Aldrich, Millipore Sigma	205-500-4
Hexane, HPLC Grade	Fisher Scientific, Spectrum Chemical	18-610-808
Methanol (HPLC)	Fisher Scienctific	A452SK-4
Retinyl Palmitate	Toronto Research Chemicals	TRC-R275450
Sodium Chloride (Crystalline/Certified ACS)	Fisher Scientific	S271-500
Instruments
1260 Infinity II Analytical Fraction Collector	Agilent	G1364F
1260 Infinity II Binary Pump	Agilent	G7112B
1260 Infinity II Diode Array Detector	Agilent	G7115A
1260 Infinity II Multicolumn Thermostat	Agilent	G7116A
1260 Infinity II Vialsampler	Agilent	G7129A
ST40R Refrigerated Centrifuge	Thermo Scientific	TSST40R
Vacufuge Plus Centrifuge Concentrator	Eppendorf	22820168
Consumables
2 mL Amber Screw Top Vials	Agilent	5188-6535
Crimp Cap with PTFE/red rubber septa, 11 mm	Agilent	5183-4498
Disposable Glass Conical Centrifuge Tubes	Millipore Sigma	CLS9950215
Screw cap tube, 15 mL	Sarstedt	62.554.502
Vial insert, 150 µL, glass with polymer feet	Agilent	5183-2088