Métodos para detectar tosse e inflamação das vias aéreas em camundongos

Resumo

Aqui, descrevemos a medição da tosse usando um sistema de pletismografia de corpo inteiro (WBP) não invasivo e em tempo real e os procedimentos normativos para a coleta de amostras de tecido de camundongos e introduzimos alguns métodos para avaliar a inflamação das vias aéreas.

Resumo

A tosse crônica, que dura mais de 8 semanas, é uma das queixas mais comuns que requerem atenção médica, e os pacientes sofrem de um enorme fardo socioeconômico e um decréscimo acentuado na qualidade de vida. Modelos animais podem mimetizar a complexa fisiopatologia da tosse e são ferramentas importantes para a pesquisa da tosse. A detecção da sensibilidade à tosse e da inflamação das vias aéreas é de grande importância para o estudo do complexo mecanismo patológico da tosse. Este artigo descreve a medição da tosse usando um sistema de pletismografia de corpo inteiro (WBP) não invasivo e em tempo real e os procedimentos normativos para a coleta de amostras de tecido (incluindo sangue, pulmão, baço e traqueia) de camundongos. Ele apresenta alguns métodos para avaliar a inflamação das vias aéreas, incluindo alterações patológicas nos cortes pulmonares e traqueiais corados com hematoxilina e eosina (HE), a concentração de proteína total, a concentração de ácido úrico e a atividade da lactato desidrogenase (LDH) no sobrenadante do fluido de lavagem broncoalveolar (BALF) e os leucócitos e contagens diferenciais de células do BALF. Esses métodos são reprodutíveis e servem como ferramentas valiosas para estudar a complexa fisiopatologia da tosse.

Introdução

A tosse é um importante comportamento de defesa para manter a permeabilidade das vias aéreas e proteger os pulmões de substâncias potencialmente nocivas. No entanto, quando desregulada, a tosse torna-se uma condição patológica¹. A tosse crônica, geralmente definida como duração de oito ou mais semanas, é um dos sintomas mais frequentes que requerem atenção médica². Como a tosse crônica freqüentemente persiste por anos, os pacientes sofrem de um enorme ônus socioeconômico e um declínio acentuado na qualidade de vida ^3,4,5. A tosse crônica é amplamente considerada uma síndrome de hipersensibilidade à tosse e é caracterizada por tosse incômoda, muitas vezes desencadeada por baixos níveis de exposição térmica, mecânica ou química⁶. A ocorrência de hipersensibilidade à tosse está intimamente relacionada à inflamação das vias aéreas⁷. No entanto, os mecanismos fisiopatológicos subjacentes à modulação da sensibilidade à tosse precisam ser mais elucidados.

Modelos animais podem mimetizar a complexa fisiopatologia da tosse e são ferramentas importantes para a pesquisa da tosse ^8,9. Estudos anteriores descobriram que infecção viral, instilação intrapulmonar de interferon-γ (IFN-γ), perfusão esofágica de ácido clorídrico, exposição a poluentes, fumaça de cigarro e ácido cítrico podem induzir tosse em animais 10,11,12,13,14,15,16,17. Para melhor avaliar a tosse e a inflamação das vias aéreas, um modelo de tosse em camundongos foi estabelecido usando uma dose não letal do vírus H1N1 neste estudo. Para a detecção da tosse, algumas ferramentas de mensuração da tosse foram estabelecidas clinicamente para medir a tosse, incluindo métodos subjetivos e objetivos¹⁸. As ferramentas de avaliação subjetiva para avaliar a gravidade da tosse incluem principalmente uma escala visual analógica, o escore de tosse e questionários de qualidade de vida, etc^19,20. No entanto, é improvável que sejam usados para avaliar a tosse em animais. Além disso, a tosse pode ser avaliada objetivamente por meio de um teste de provocação da tosse e monitoramento da frequência da tosse. O teste de provocação da tosse usando um sistema de pletismografia de corpo inteiro (WBP) é um método objetivo amplamente utilizado em estudos com animais para medir a sensibilidade à tosse e revelar os mecanismos subjacentes da tosse^13,16. Com base nas características neuroanatômicas do reflexo da tosse, ácido cítrico, capsaicina, adenosina 5'-trifosfato (ATP), isotiocianato de alila (AITC) e mediador inflamatório bradicinina são comumente usados como agentes tussígenos para induzir a tosse^21,22. O ácido cítrico é um dos primeiros e mais amplamente utilizados agentes tussígenos que desencadeiam os reflexos da tosse, que foi validado para medir a sensibilidade à tosse. Além disso, o desafio com ácido cítrico tem boa segurança, viabilidade e tolerabilidade e é sugerido para avaliar a sensibilidade do reflexo da tosse em resposta a terapias para tosse²³. Portanto, este artigo descreverá o método para medir a sensibilidade à tosse em resposta ao ácido cítrico em camundongos usando um sistema WBP não invasivo e em tempo real.

Os estudos da fisiopatologia da tosse requerem amostras de teste, incluindo amostras de sangue, lavado broncoalveolar (LBA) e tecidos pulmonares e traqueia, para verificar alterações nos níveis de fatores-chave²⁴. Atualmente, faltam procedimentos normativos para a coleta de amostras de tecido de camundongos, e estudos relacionados empregam diferentes abordagens que complicam a avaliação da inflamação das vias aéreas. O lavado broncoalveolar é um método importante para avaliar a inflamação das vias aéreas em doenças respiratórias²⁵. Diferentes métodos de lavagem broncoalveolar levarão a uma falta de comparabilidade entre os estudos relacionados. Além disso, diferentes métodos de lavagem broncoalveolar têm impacto nas células inflamatórias e citocinas inflamatórias no LBA. Portanto, este artigo descreverá o estabelecimento de um modelo de tosse em camundongos com uma dose não letal do vírus H1N1, a medição da tosse usando um sistema WBP e um método de lavagem broncoalveolar confiável, seguro e altamente bem-sucedido em camundongos.

Protocolo

Todos os procedimentos foram aprovados pelo Comitê de Cuidados e Uso de Animais da Universidade Médica de Guangzhou (20240248) e foram realizados em estrita conformidade com as diretrizes aprovadas. Camundongos C57BL/6 machos livres de patógenos específicos pesando 20-25 g foram usados neste estudo. Todos os camundongos foram alojados sob temperatura controlada (22 ± 2 °C), umidade (50% ± 20%) e iluminação (6h30 às 18h30) em gaiolas de fundo sólido com comida e água disponíveis ad libitum. A linha do tempo do protocolo é mostrada na Figura 1.

1. Estabelecimento de um modelo de tosse em camundongos

1. Use o vírus influenza A/California/7/2009 (H1N1). Determine a dose letal do vírus H1N1 em camundongos.
   1. Resumidamente, anestesiar camundongos (n = 10 por grupo) com pentobarbital sódico (80 mg · ^kg-1) e, em seguida, infectar por via intranasal com um vírus diluído em série de 10 vezes.
   2. Monitore a morte por um período de 15 dias. Calcular a dose letal mediana (DL₅₀) pelo método de Reed-Muench²⁶.
2. Infecte o camundongo com o vírus H1N1.
   1. Dissolva 0,8 x LD₅₀ do vírus H1N1 em 50 μL de solução salina tamponada com fosfato (PBS).
   2. Anestesiar os camundongos com pentobarbital sódico (80 mg · ^kg-1).
   3. Quando os camundongos estiverem profundamente anestesiados, coloque-o em decúbito dorsal com as narinas voltadas para cima.
   4. Instilar 5-10 μL de solução do vírus H1N1 ou solução de PBS (como controle) por via intranasal em uma narina de camundongos usando uma pipeta (Figura 2A).
   5. Em seguida, mantenha a boca do camundongo fechada com o polegar para fazer o nariz inalar com força, de modo que a solução do vírus H1N1 na cavidade nasal seja completamente inalada para os pulmões (Figura 2B).
   6. Repita as etapas 1.2.4 e 1.2.5 na outra cavidade nasal dos camundongos.
   7. Quando todo o vírus H1N1 preparado na etapa 1.2.1 for instilado por via intranasal nos pulmões do camundongo, coloque-o na posição supina para repouso ( Figura 2C ).
3. Meça a sensibilidade à tosse do camundongo após o estabelecimento do modelo usando o sistema de pletismografia de corpo inteiro de pequenos animais Buxco. No dia 21, anestesiar o camundongo por via intraperitoneal com pentobarbital sódico (150 mg · ^kg-1). Colete e processe sangue, baço, LBA, pulmão e traqueia (Figura 1).

2. A medição da sensibilidade à tosse

1. Prepare ácido cítrico (0,4 M): Coloque 0,1537 mg de ácido cítrico em um tubo de centrifugação de 5 mL e adicione solução salina normal a um volume de 2 mL.
2. Inspeção de instrumentos
   1. Verifique os canais: Conecte as câmaras de pletismógrafo de corpo inteiro de acordo com as instruções do fabricante e clique no botão de calibração - o botão de calibração muda de laranja para verde, indicando que a calibração foi bem-sucedida (Figura 3A).
   2. Calibre o nebulizador:
      1. Depois de conectar o nebulizador, adicione 500 μL de solução salina normal ao nebulizador e clique no botão de nebulização.
      2. Quando o líquido no nebulizador estiver completamente aerossolizado, clique no botão de nebulização novamente para ver a potência do nebulizador, que geralmente é de cerca de 0.3 mL/min. Clique no botão de nebulização novamente para aceitar a energia nebulizada atual.
   3. Depois de verificar os canais, certifique-se de que o valor do erro seja inferior a 0,5%.
3. Parâmetros de configuração
   1. Clique em Criar Novo Estudo, selecione a opção Tosse , selecione Mouse em Espécies e clique em Avançar.
   2. Selecione os parâmetros CCnt : Defina a duração do período de aclimatação para 1 min, o tempo de resposta para 10 min, o volume do aerossol para 1 mL e a duração da entrega para 10 min.
   3. Coloque o rato consciente e desenfreado em câmaras pletismógrafos de corpo inteiro transparentes de plástico individuais. Insira o peso e o ID do assunto do mouse e clique em Avançar.
   4. Adicione 1 mL de solução de ácido cítrico (0,4 M) ao nebulizador e observe as alterações em tempo real no CCnt (Figura 3B).
   5. Depois que o ácido cítrico for completamente usado, clique em Arquivo e Encerrar Sessão para concluir o experimento.

3. Coleta de tecidos de sangue, baço, LBA, pulmão e traqueia de camundongos (Figura 4)

1. Colete sangue.
   1. Após a detecção da tosse, anestesiar o camundongo com pentobarbital sódico (150 mg · ^kg-1) por injeção intraperitoneal. Colete sangue das órbitas do camundongo profundamente anestesiado. Misture 1 mL de sangue em 0,1 mL de tampão anticoagulante (9,9 mg / mL de heparina sódica dissolvida em PBS) a 4 ° C (Figura 4A).
   2. Agite o tubo de coleta de sangue para misturar totalmente o sangue e o anticoagulante para evitar a coagulação do sangue.
   3. Centrifugue o sangue coletado a 800 x g por 5 min a 4 °C. Colete o sobrenadante, armazene-o a -80 ° C (usado para medição de citocinas) e ressuspenda o pellet em 1 mL de solução de D-Hank. Espalhe 10 μL da suspensão de células sanguíneas na lâmina de vidro para determinar os perfis celulares.
2. Colha o baço.
   1. Abra o peito do camundongo, colete o sangue e exsanguine pela artéria (Figura 4B).
   2. Remover a aurícula esquerda e, em seguida, perfundir a circulação pulmonar e sistêmica com 5 mL de solução salina normal (Figura 4C, D). Remova todo o baço do camundongo usando uma pinça cirúrgica (Figura 4E).
   3. Depois de medir o peso do baço, corte-o em duas metades. Fixar a primeira metade com paraformaldeído a 4% à temperatura ambiente (RT) para análise histopatológica. Armazene a segunda metade a -80 °C para medição de citocinas.
3. Lavagem broncoalveolar
   1. Faça o tubo de lavagem broncoalveolar usando uma pipeta de Pasteur. Aqueça a pipeta Pasteur usando uma lâmpada de álcool. Quando ficar macio, alongue-o para formar um tubo fino. O comprimento do tubo de lavagem broncoalveolar é de 5 cm. O diâmetro superior é de 5 mm e o diâmetro inferior é de 1 mm (Figura 5).
   2. Para a coleta de LBA, separe o pulmão direito ligando o brônquio principal direito. Colete o LBA do pulmão esquerdo lavando três vezes com 0,5 mL de PBS pré-resfriado em gelo. A taxa de recuperação do LBA é superior a 80% (Figura 4F).
   3. Centrifugar o BALF recolhido a 800 x g durante 5 min a 4 °C. Colete o sobrenadante e meça a concentração total de proteínas, a concentração de ácido úrico, a atividade de LDH e as concentrações de citocinas.
      NOTA: Os marcadores inflamatórios, incluindo a concentração de proteína total, a concentração de ácido úrico e a atividade de LDH no sobrenadante do LBA, são detectados usando o kit de ensaio de acordo com as diretrizes do fabricante²⁴.
   4. Ressuspenda o pellet em 200 μL de PBS e conte os leucócitos em BALF com a ajuda de uma lâmina de contagem.
   5. Para determinar os perfis celulares por contagens diferenciais, espalhe 50 μL da suspensão celular nas lâminas de vidro e deixe secar.
   6. Fixe a lâmina com paraformaldeído a 4% durante a noite e, em seguida, core com a hematoxilina-eosina (HE). Classifique pelo menos 400 células em neutrófilos, macrófagos, linfócitos ou eosinófilos por lâmina.
4. Coleta de tecidos pulmonares e traqueiais para análise histopatológica
   1. Após a coleta do LBA, remover e fixar metade do pulmão direito (Figura 4G) e traqueia (Figura 4H) com paraformaldeído a 4% no TR para análise histopatológica. Armazene a outra metade a -80 ° C para western blotting, reação em cadeia da polimerase quantitativa em tempo real (qPCR) e ensaio de imunoabsorção enzimática (ELISA).

Resultados

A Figura 6 mostra imagens representativas de alterações patológicas no pulmão corado com HE (Figura 6A, B), traqueia (Figura 6C, D) e baço (Figura 6E, F). A infecção pelo vírus H1N1 resultou em alterações inflamatórias nos pulmões de camundongos, incluindo edema e muitos linfócitos e infiltração de neutrófilos. A infecção pelo vírus H...

Discussão

Algumas tosses crônicas refratárias e pós-infecciosas são condições comuns associadas à infecção por vírus respiratórios²⁷. Para melhor avaliar a sensibilidade à tosse e a inflamação das vias aéreas, um modelo de tosse em camundongos foi estabelecido usando o vírus H1N1 neste estudo. Modelos apropriados de tosse em camundongos devem ser selecionados para outros estudos de acordo com o objetivo do estudo. A maioria dos estudos anteriores utilizou a cobaia como modelo animal em estud...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
4% paraformaldehyde	Biosharp	BL539A
Buxco Small Animal Whole Body Plethysmography System	DSI	—
Calcium-free and magnesium-free Hank’s Balanced Salt Solution	Beyotime	C0219
Citric acid	Sigma-Aldrich	C2404
Hematoxylin-Eosin	BASO Biotechnology	BA-4098
Heparin sodium	Alfa Aesar	A16198
Influenza A/California/7/2009 (H1N1) virus	ATCC	VR-1894
Isoflurane	RWD	R510-22
Lactate dehydrogenase assay kit	Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute	A020-2-2
Normal saline	Guangzhou Zhongbo Biotechnology	1234-1
Pasteur pipet	NEST	318415
Pentobarbital sodium	Merck	P3761
Phosphate buffered saline	Meilunbio	MA0015
Total protein assay kit	Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute	A045-3
Uric acid assay kit	Thermo Fisher Scientific	A22181