Utilizando o ensaio de deslocamento térmico para sondar a ligação do substrato à selenoproteína O

Resumo

Aqui, apresentamos o ensaio de deslocamento térmico, uma técnica baseada em fluorescência de alto rendimento usada para investigar a ligação de pequenas moléculas a proteínas de interesse.

Resumo

Definir a importância biológica de proteínas com funções desconhecidas representa um obstáculo significativo na compreensão dos processos celulares. Embora as previsões bioinformáticas e estruturais tenham contribuído para o estudo de proteínas desconhecidas, as validações experimentais in vitro são frequentemente dificultadas pelas condições ideais e cofatores necessários para a atividade bioquímica. A ligação ao cofator não é apenas essencial para a atividade de algumas enzimas, mas também pode aumentar a estabilidade térmica da proteína. Uma aplicação prática desse fenômeno reside na utilização da mudança na estabilidade térmica, medida por alterações na temperatura de fusão da proteína, para sondar a ligação do ligante.

O ensaio de deslocamento térmico (TSA) pode ser usado para analisar a ligação de diferentes ligantes à proteína de interesse ou encontrar uma condição estabilizadora para realizar experimentos como cristalografia de raios-X. Aqui, descreveremos um protocolo para TSA utilizando a pseudoquinase, Selenoproteína O (SelO), para um método simples e de alto rendimento para testar a ligação de metais e nucleotídeos. Em contraste com as quinases canônicas, o SelO se liga ao ATP em uma orientação invertida para catalisar a transferência de AMP para as cadeias laterais de hidroxila das proteínas em uma modificação pós-traducional conhecida como AMPilação da proteína. Ao alavancar a mudança nas temperaturas de fusão, fornecemos informações cruciais sobre as interações moleculares subjacentes à função do SelO.

Introdução

Grande parte do proteoma humano permanece mal caracterizado. O "efeito de iluminação pública" descrito por Dunham e Kustatscher et al. refere-se ao fenômeno em que proteínas extensivamente pesquisadas recebem mais atenção, deixando as proteínas pouco estudadas negligenciadas ^1,2. Os fatores que contribuem para esse efeito incluem a importância biológica e a relevância da doença de certas proteínas. Além disso, pesquisas prévias que oferecem conhecimento fundamental, bem como a disponibilidade de ferramentas para análise funcional, estimulam ainda mais a pesquisa sobre

Protocolo

1. Configuração experimental

1. Use um termociclador que possa detectar fluorescência, como um instrumento RT-PCR, para executar o protocolo descrito. Se estiver usando o SYPRO Orange, conforme descrito neste protocolo, use um modo de varredura que permita excitação em torno de 470 nm e detecção de emissão em torno de 570 nm. Programe o termociclador para manter a amostra a 20 °C por 2 min, seguido de um aumento de temperatura de 0,5 °C/1 min até 95 °C; medir a intensidade da fluorescência a cada 1 °C.
   NOTA: Recomendamos uma etapa opcional no final do ciclo para retornar o sample bloco a 20 °C (

Discussão

O Thermal Shift Assay (TSA) serve como um método eficiente para rastrear interações proteína-ligante, incluindo aquelas com cofatores e inibidores. Neste protocolo, usamos TSA para medir a ligação da pseudoquinase SelO a nucleotídeos e cátions divalentes. Nossos achados mostram que o SelO exibe maior estabilidade térmica na presença de ATP e Mg²⁺/Mn²⁺. Esta observação se alinha com relatórios anteriores indicando que homólogos SelO de E. coli, S. c.......

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Adenosine 5′-triphosphate disodium salt hydrate	Sigma Aldrich	A2383-10G	used for representative results but not required to perfom TSA
Avanti J-15R with microplate carrier assembly	Beckman Coulter	C19416
CFX Opus 384 Real-time PCR system	Bio-Rad	12011452
Hard-Shell 384-Well PCR Plates, thin wall, skirted, clear/white	Bio-Rad	HSP3805
Magnesium Chloride	Sigma Aldrich	M8266-100G	used for representative results but not required to perfom TSA
Manganese (II) chloride tetrahydrate	Sigma Aldrich	M3634-500G	used for representative results but not required to perfom TSA
Microseal 'B' PCR Plate Sealing Film, adhesive, optical	Bio-Rad	MSB1001
SYPRO Orange Protein Gel stain	Sigma Aldrich	S5692-500UL
Uridine 5′-triphosphate trisodium salt hydrate	Sigma Aldrich	U6625-100MG	used for representative results but not required to perfom TSA