Técnica otimizada e simplificada para a produção e cultura de fatias de fígado cortadas com precisão

Resumo

Um protocolo para a produção e cultura de fatias de fígado cortadas com precisão (PCLS) para o estudo de fígados de camundongos. O artigo enfoca os principais aspectos do protocolo, que requer apenas equipamento de laboratório padrão com acesso a um vibratomo e permite a sobrevivência do PCLS por um período mínimo de 4 dias.

Resumo

Este protocolo apresenta um sistema simples para a criação e cultura de fatias de fígado cortadas com precisão (PCLS). O PCLS contém todas as células em um ambiente intacto e, portanto, se assemelha a um mini modelo de todo o órgão. Eles permitem o estudo de tecidos vivos enquanto replicam seus fenótipos complexos. Este protocolo permite a preparação de fatias de fígados de camundongos usando um vibratomo e equipamento de laboratório padrão. Os protocolos para produção e cultura de PCLS carecem de padronização e podem variar drasticamente dependendo do tecido de interesse, do tipo de vibratomo usado e da necessidade de oxigênio. Estes podem ser difíceis de reproduzir em alguns laboratórios que têm apenas acesso a um vibratomo básico e instalações comuns de cultura de tecidos. Reunimos um protocolo com foco na importância de algumas etapas-chave dentro dos vários protocolos já disponíveis. Este protocolo, portanto, enfatiza a importância do método de embutimento, a orientação do corte, um sistema dinâmico versus estático e a relevância de um volume mínimo de cultura. Este protocolo pode ser estabelecido e reproduzido de maneira simples na maioria dos laboratórios que têm acesso a um fatiador de tecido básico. Tomados em conjunto e seguindo este protocolo, o PCLS pode permanecer vivo por um período mínimo de 4 dias. O PCLS é um modelo simples, econômico e reprodutível para estudar a triagem fisiopatológica e terapêutica de órgãos como o fígado.

Introdução

Fatias de tecido cortadas com precisão (PCTS) são seções finas de órgãos. Eles permitem a preservação da arquitetura do órgão replicando um mini-órgão, preservando o aspecto tridimensional das células vizinhas e da matriz extracelular. É um modelo atraente devido ao seu fácil acesso, economia de custos e características menos trabalhosas, preservando a arquitetura do tecido.

O PCTS preenche uma lacuna entre os estudos celulares in vitro e a pesquisa animal in vivo, superando a maioria das desvantagens de ambos os modelos. A PCTS foi gerada a partir de vários órgãos, como fígado¹, intestinos ^2,3, cólon², cérebro ^4,5, pulmão ^6,7,8, rim ^9,10, baço^11,12, coração^13,14 mas também tumores^15,16. Eles também podem se originar de vários animais, como camundongo¹, rato^17,18, mas também porco¹⁹ e resíduos cirúrgicos humanos 15,20,21. Embora os PCTS exijam o uso de animais, implicando em questões éticas, o órgão de um animal pode gerar múltiplos PCTS, reduzindo assim o número de animais de acordo com as diretrizes NC3Rs (Redução, Substituição, Refinamento)²² e limitando as variações interindividuais.

O desenvolvimento de fatiadores de tecido aprimorados, por exemplo, vibratomos²³, permitiu uma transição de fatias cortadas manualmente caracterizadas por espessura heterogênea e baixa taxa de sobrevivência para fatias mais finas reprodutíveis com integridade estrutural mais bem preservada.

No entanto, os protocolos para PCTS e, mais especificamente, preparação e cultura de fatias de fígado de corte de precisão (PCLS) variam significativamente na literatura e carecem de padronização, especialmente para parâmetros essenciais, como equipamento de fatiamento, teor de meio e condições de cultura. Os protocolos também podem variar visivelmente dependendo do tecido de origem. Alguns dos protocolos exigirão oxigenação do tampão ou cultura com alguns sistemas complicados de biorreatores²⁴. Eles geralmente se concentram individualmente em diferentes aspectos técnicos ou são projetados para diferentes tecidos e muitas vezes podem ser caros e mais difíceis de reproduzir no laboratório médio de maneira econômica.

Aqui, este protocolo reúne alguns pontos-chave, como o método de incorporação, a direção do corte, o uso de transpoços²⁵, um sistema de cultura dinâmico²⁶ e a importância de um volume mínimo de cultura. Algumas dessas etapas foram previamente otimizadas de forma independente ou em um contexto diferente, como fibrose²⁷ ou resposta tumoral²⁸. Este protocolo também enfatiza a importância da incorporação usando certos tipos de fatiadores e a orientação do corte, que são parâmetros difíceis de dominar e muitas vezes negligenciados na literatura. Este método simples gera PCLS mantido em cultura por um período mínimo de 4 dias com uma configuração fácil e usando equipamento de laboratório padrão com acesso a um cortador de tecido rudimentar.

Protocolo

Camundongos CD57Bl / 6J do tipo selvagem foram comprados da Charles River Laboratories. Os camundongos tiveram livre acesso a comida e água, alojados em gaiolas ventiladas individualmente com condições controladas de temperatura e umidade e com um ciclo de luz de 12 h. Animais com 3 semanas de idade foram sacrificados e os fígados foram prontamente colhidos sem perfusão. Todo o trabalho com animais foi aprovado após revisão ética local pelo Conselho de Revisão Ética e Bem-Estar Animal da University College London e realizado sob a licença de projeto do Home Office PP9223137 e de acordo com a Lei de Procedimentos Científicos do Home Office (Animais) (1986) e as diretrizes ARRIVE. Todos os esforços foram feitos para limitar os danos aos animais de acordo com a prática padrão da Unidade de Serviços Biológicos da University College London.

1. Prepare-se para o experimento

1. No dia anterior à colheita, execute as seguintes etapas.
   1. Prepare 1 L de tampão Krebs-Henseleit (KREBS) dissolvendo um frasco de pó de Krebs em 1 L de água estéril. Arrefecer até 4 °C e mantê-lo sobre gelo húmido.
   2. Desinfete a bandeja com etanol a 70% e enxágue com PBS estéril. Mantenha a bandeja embrulhada em papel alumínio na geladeira durante a noite para ajudar a manter um ambiente frio durante o corte.
   3. Pulverize todas as outras partes removíveis com etanol, enxágue com PBS estéril, deixe secar e mantenha-as estéreis. Autoclave as lâminas e mantenha-as estéreis até o uso.
   4. Prepare agarose de baixo ponto de fusão a 4% p / v em água estéril. Depois de ressuspensa e derretida, conservar a agarose no frigorífico a 4 °C.
2. No dia da colheita e antes da colheita do fígado, execute as seguintes etapas.
   1. Derreta a agarose de baixo ponto de fusão a 4% e mantenha-a em banho-maria a 37 °C até o uso. Certifique-se de que a agarose esfriou até 37 °C e que todas as bolhas se dissiparam antes de usar.
   2. Prepare as placas de cultura adicionando, respectivamente, 2,6 mL, 1,5 mL e 0,7 mL por poço em placas de 6, 12 e 24 poços. Adicione inserções porosas de 8 μm a cada poço. Coloque as placas em uma incubadora umidificada ajustada para 37 °C, 5% de CO₂ e 21% de nível de O₂ . Isso ajudará a ajustar o pH enquanto aquece o meio, para que esteja pronto para a cultura.
   3. Cultivar as fatias com insertos porosos de 8 μm para permitir o acesso a ambas as faces da fatia. Prepare o meio da seguinte forma: Adicione ao meio de William E (WME), suplemento de L-glutamina 2 mM, soro bovino fetal (FBS) a 10%, penicilina 100 U / mL e estreptomicina 100 μg / mL, 10 μg / mL de gentamicina, solução de D-glicose 25 mM e solução de HEPES 15 mM.

2. Coleta de fígado e preparação (15 min)

1. Esterilize todos os instrumentos antes da colheita.
2. Anestesiar o camundongo de acordo com os procedimentos locais para o cuidado de animais para fins científicos, usando uma máscara de isoflurano. Antes de abrir a cavidade abdominal, aperte entre os dedos dos pés para garantir que o animal esteja devidamente anestesiado. Se o fígado puder ser removido rapidamente, o camundongo pode ser sacrificado por asfixia por CO₂ ou luxação cervical. Como o procedimento é um procedimento terminal, não use pomada para os olhos, pois isso não afetaria o animal.
3. Pulverize o abdômen com etanol 70%. Opcional: Raspe o mouse para evitar contaminação com pelos.
4. Abra a cavidade abdominal com pinças e tesouras estéreis, cortando a pele e o peritônio do meio do abdômen. Disseque o fígado suavemente de outros órgãos ou vasos e evite danificar os lobos.
5. Armazene todo o fígado imediatamente em Krebs Buffer gelado. Execute todas as etapas seguintes no gelo a 4 °C e prossiga para a preparação do fígado o mais rápido possível para evitar mais morte celular.

3. Incorporação dos lobos do fígado (25 min para cada lobo do fígado)

1. Transfira o fígado para uma placa de Petri no gelo contendo tampão Krebs gelado, certificando-se de que todo o fígado esteja totalmente submerso.
2. Separe cada lóbulo individualmente usando uma pinça romba e uma faca afiada e estéril para evitar danificar os lóbulos.
3. Escolha o primeiro lóbulo para seccionar e mantenha os lóbulos restantes em um tampão Krebs gelado até que estejam prontos para serem incorporados e fatiados.
4. Corte todas as bordas para obter um lóbulo mais gerenciável com bordas retas prontas para incorporação. Isso também ajudará a remover parte da cápsula fibrosa de Glisson para facilitar ainda mais o seccionamento. Faça isso mantendo as superfícies do fígado molhadas em um tampão Krebs gelado.
5. Coloque uma placa de Petri de 3 cm (ou similar) sobre gelo úmido e despeje a agarose de baixo ponto de fusão a 4% (já em banho-maria a 37 ° C). Mantenha bem no gelo para permitir que a agarose esfrie para cima, evitando que o lóbulo afunde e incorpore-o uniformemente.
6. Deixe a agarose esfriar ainda mais por 30 s e coloque o lóbulo aparado nela. O lóbulo se acomodará no meio do bloco de agarose. O processo de incorporação requer prática e otimização para se adequar a todas as condições de laboratório e experiência pessoal.
7. Coloque o lóbulo embutido, ainda no gelo, na geladeira por 5 min. A agarose deve então ser claramente definida.
8. Corte a parte externa do bloco de agarose. Desaloje o bloco de agarose do prato.
9. Corte a agarose em um tamanho mais manejável, garantindo que o lado superior e o lado colado à plataforma do vibratomo fiquem paralelos à borda superior do lóbulo.
10. Inicie o processo de fatiamento o mais rápido possível, mas certifique-se de que o bloco de agarose seja mantido em um tampão Krebs gelado e no gelo.

4. Produção de fatias de fígado (40 min por lóbulo)

1. Defina o vibratomo para corte com uma espessura de 250 μm, com uma velocidade de 5 e uma frequência de 7 Hz. Esses são parâmetros orientadores; Dependendo do tipo de vibratomo usado, isso pode exigir otimização.
2. Pulverize as áreas do vibratomo e da bancada com etanol 70% antes de cortar para manter o ambiente o mais estéril possível.
3. Coloque a bandeja no vibratomo e despeje gelo ao redor. Coloque as lâminas no vibratomo em um ângulo de 10° para baixo e abaixo da horizontal.
4. Encha o tanque de vibratomo com tampão Krebs gelado. Coloque uma fina camada de cola de cianoacrilato na plataforma.
5. Seque a borda do bloco de agarose que será colado na plataforma usando um tecido absorvente estéril.
6. Coloque o bloco de agarose na plataforma removível. Posicione o lóbulo na vertical para permitir que seja cortado transversalmente. Embora o tamanho das fatias seja reduzido, isso facilita drasticamente o processo de corte, limitando a pressão contra o lóbulo durante o corte.
7. Aguarde 1 minuto para que a cola endureça e submerja a plataforma removível no tanque e certifique-se de que o bloco de agarose esteja completamente coberto com tampão Krebs.
8. Programe o vibratomo para corte definindo as posições de início e parada. Comece a cortar fatias mais grossas inicialmente até atingir o lóbulo do fígado.
9. Descarte a primeira fatia, pois pode não ser cortada na espessura certa. Para evitar danificar as fatias, use uma espátula para coletar as fatias de fígado em vez de pinças ou escovas.
   NOTA: Uma pequena escova desinfetada com etanol 70% e enxaguada com PBS estéril também pode ser usada para guiar suavemente o tecido durante o processo de corte.
10. Repita o processo até atingir o número necessário de fatias. O lóbulo pode ocasionalmente se desalojar da agarose, impedindo o uso posterior. Colete as fatias em um tampão Krebs gelado até a cultura.

5. Incubação de fatias de fígado

1. Transfira as fatias, usando uma espátula, para os poços preparados contendo a mídia e as inserções.
2. Coloque as placas em um agitador orbital, ajuste a velocidade em 130 rpm e incube usando uma incubadora de cultura de células convencional com 5% de CO2 e 21% de O2 a 37 °C. O volume final de cultura é de 2,6 mL, 1,5 mL e 0,7 mL por poço em placas de 6, 12 e 24 poços, respectivamente.
3. Coloque uma placa vazia abaixo da placa de cultura que contém as fatias em cultura para permitir que qualquer calor excessivo proveniente da plataforma do agitador seja dissipado. Troque o meio a cada 48 h.

6. Ensaio de sobrevivência celular

1. Transfira as fatias para uma placa de 48 poços contendo 400 μL de meio Medium E de Williams completo pré-aquecido e adicione 80 μL de MTS (3- (4,5-dimetiltiazol-2-il) -5- (3-carboximetoxifenil) -2- (4-sulfofenil) -2H-tetrazólio) reagente de tetrazólio).
2. Após a incubação por 1 h a 37 °C, 5% de CO₂ em um agitador, transfira 200 μL de meio para uma placa de 96 poços e meça a absorbância a 490 nm usando um leitor de placas de vários poços. Utilizar as fatias deixadas na bancada em PBS e à temperatura ambiente durante 24 h como controlos negativos.

7. Coloração histológica

1. Desparafinizar e reidratar as seções usando xileno e etanol, seguido de água deionizada. Manchar as secções com solução de hematoxilina durante 3 min.
2. Enxágüe com água deionizada por 5 min. Mergulhe rapidamente 10x em etanol ácido (1 mL de HCL concentrado e 400 mL de etanol a 70%).
3. Enxágue 2x em água deionizada e seque o excesso de água. Mergulhe as seções em Eosin por 30 s.
4. Desidrate em etanol a 95% e, em seguida, etanol a 100% por 5 min, 3x cada. Mergulhe as seções em xileno 3x por 15 minutos cada. Coloque lamínulas nas lâminas.

Resultados

Na colheita, a perfusão do animal é propositalmente omitida para garantir o processamento rápido do órgão e evitar danos aos órgãos. O fígado é extraído rapidamente após a incisão e imediatamente colocado em um tampão protetor de órgãos gelado, por exemplo, tampão Krebs^24,29. Embora o corte de tecido hepático fresco sem incorporação tenha sido descrito anteriormente¹, a inclusão do fíg...

Discussão

Demonstramos que a produção e a cultura de PCLS podem ser facilmente alcançadas, garantindo uma meia-vida de pelo menos 4 dias. Este protocolo recapitula cinco etapas críticas: o método de incorporação se este tipo de vibratomo for usado, a orientação do corte, um sistema dinâmico de cultura, um volume mínimo de cultura e o uso de inserções.

Protocolos para a produção e cultura de PCLS estão comumente disponíveis. No entanto, eles carecem de p...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
3 cm petri dish	Any		any suitable for cell culture
6, 12, 24 well culture plate	Any		any suitable for cell culture
Cyanoacrylate super glue	Any
D-Glucose	Gibco	A24940
Eosin	Merck	HT110316
Ethanol	Any
Fetal Bovine serum	ThermoFisher	26400044
Gentamycin	Gibco	15750060
Hematoxylin	Merck	51275
HEPES	Gibco	H0887
inserts 8um, for 12 well plates	Strastedt	83.3931.800
inserts 8um, for 24 well plates	Strastedt	83.3932.800
inserts 8um, for 6 well plates	Strastedt	83.3930.800
KREBS	Merck	K3753
Laminar Flow Hood			Hepa air filtration
Low melting agarose	ThermoFisher	16520050
MTS tetrazolium reagent	Abcam	ab197010
multi-well plate reader	Any
PBS tablets	ThermoFisher	P4417
Penicillin/Streptomycin	Gibco	15140-122
Scalpel blade	Any
Surgical forceps	Any		with a flat square-tip
Surgical scissors	Any
Vibratome	Leica	VT1000 S
William’s Medium E with GlutaMAX (WME)	ThermoFisher	W4125