Um método rápido para confinar e manusear com segurança as abelhas no campo

Resumo

Demonstramos um método testado para manusear com segurança abelhas coletadas em campo. Este método permite rápida manipulação, identificação, amostragem genética e confirmação das interações planta-inseto por meio do pólen coletado durante a amostragem. Facilmente adaptável, essa abordagem oferece um meio econômico e não letal para estudar grupos raros de insetos.

Resumo

Melhorar a compreensão da biologia básica e ecologia de muitos insetos polinizadores, particularmente táxons especializados ou raros, é uma prioridade para muitos pesquisadores. Como tal, muitas vezes há a necessidade de confinar temporariamente os organismos coletados em campo de maneira não prejudicial, a fim de obter informações ou apoiar estudos adicionais. Este protocolo representa um método de campo exaustivamente testado, rápido e barato para lidar com segurança com abelhas de preocupação com a conservação que pode ser facilmente adaptado às necessidades específicas do projeto, incluindo identificação de organismos, remoção de pólen, marcação e / ou coleta de amostras de tecido não letais para análise genética. Essa metodologia pode servir como uma opção adicional na caixa de ferramentas do pesquisador para usar quando determinados cenários surgirem. Prevê-se que esta metodologia possa ser adaptada para uso com outras espécies de insetos, bem como usada por indivíduos de diferentes níveis de experiência e habilidade. Pode ser de grande valor para pesquisadores que estudam abelhas especializadas ou conduzem estudos específicos do hospedeiro. A coleta de dados possibilitada por este protocolo será inestimável para ajudar os pesquisadores a abordar lacunas críticas de dados para muitas espécies de polinizadores, estruturas de rede planta-polinizador e iniciativas de conservação e manejo de polinizadores.

Introdução

Um crescente corpo de evidências apóia o declínio da população de abelhas selvagens e outros polinizadores e as mudanças na comunidade de polinizadores 1,2,3,4. Perdas contínuas ameaçam o próprio serviço de polinização por insetos vital para a manutenção da biodiversidade, função do ecossistema e produção agrícola⁵. Além disso, para muitas abelhas selvagens, especialmente espécies raras, existem lacunas significativas de conhecimento que podem dificultar ações adequadas de manejo e conservação ^6,7.

Para ajudar a resolver essas deficiências de dados, os pesquisadores desenvolveram uma variedade de métodos para estudar insetos polinizadores, uso de habitat associado e suas preferências florais. Embora armadilhas de panela, armadilhas de palhetas azuis, armadilhas de mal-estar, armadilhas de emergência e coleta direta por rede manual sejam comumente utilizadas, muitos desses métodos têm desvantagens significativas 8,9,10,11. Métodos comumente empregados para identificar o polinizador podem resultar em mortalidade do organismo, independentemente de a amostra precisar ser identificada em um ambiente de laboratório (por exemplo, usando um microscópio). A mortalidade pode ser justificável e necessária para muitos estudos com insetos. No entanto, ao trabalhar com insetos ameaçados, raros ou pouco estudados, cujos status populacionais são limitados ou incertos, os pesquisadores devem mitigar a mortalidade, lesão ou estresse do organismo para reduzir a probabilidade de impactar negativamente essas populações de insetos. Por conseguinte, ao trabalhar com espécies em risco ou espécies que possam ser facilmente identificadas pelas suas principais características distintivas, devem ser adotadas, se possível, abordagens de amostragem menos destrutivas.

Os métodos não letais propostos para a coleta de material genético de abelhas incluem coleta de fezes, exúvias¹² e pontas das asas¹³. No entanto, a utilização desses métodos em abelhas coletadas no campo pode ser insustentável devido ao tempo necessário e/ou impacto potencial nas asas, afetando negativamente o voo e outros comportamentos. A remoção parcial das antenas demonstrou não comprometer a sobrevivência das abelhas euglossinas amostradas¹⁴. Da mesma forma, a amostragem da porção terminal do tarso do meio da perna não reduziu significativamente a sobrevivência do trabalhador Bombus terrestris ¹⁵. Um método adicional de amostragem não letal envolve a coleta de resíduos de proteínas imergindo temporariamente as abelhas em uma solução tampão e, posteriormente, liberando-as¹⁶. A análise de sobrevivência mostrou que não houve diferenças significativas entre as abelhas enxaguadas e não enxaguadas. Existem limitações para cada técnica, que devem ser consideradas ao abordar questões específicas de pesquisa e objetivos gerais do projeto.

A identificação taxonômica precisa de organismos é fundamental para uma pesquisa eficaz. Para muitos táxons de insetos polinizadores, no entanto, é extremamente dependente da espécie de interesse e do nível de conhecimento e experiência do pesquisador ou observador. Embora muitas espécies de abelhas possam ser identificadas em campo, ter evidências para apoiar a observação pode ser crítico. Embora a maioria dos estudos de polinizadores normalmente colete e retenha indivíduos como evidência, o uso de fotos e vídeos, bem como a videografia tridimensional usando realidade virtual, podem ser utilizados como um proxy para distinguir certas espécies sem o sacrifício dos indivíduos observados¹⁷. A diferenciação entre algumas espécies pode exigir atenção especial e fotografias de características morfológicas específicas; Nessas situações, os organismos devem ser capazes de ser manipulados e confinados a uma posição única, de modo que os caracteres distintivos complexos possam ser fotografados de forma confiável.

O confinamento temporário das abelhas para identificação pode ser feito de várias maneiras, incluindo o resfriamento do espécime e / ou o uso de dióxido de carbono para desacelerar as abelhas^18,19. No entanto, esses métodos podem alterar o comportamento, resultando em abelhas tratadas mais lentas para recuperar a atividade, possivelmente afetando o forrageamento, a aptidão do organismo ou aumentando o risco de predação 20,21,22. Além disso, essas técnicas aumentam o tempo em que os organismos são confinados e manuseados. Isso, por sua vez, aumenta o estresse do organismo e o tempo de processamento em campo. Metodologias mais seguras e eficientes seriam, portanto, altamente desejáveis.

Vários estudos usaram o pólen coletado de abelhas ou outras fontes para entender melhor as preferências de forrageamento, construir redes de interação planta-polinizador, identificar contaminação ambiental (por exemplo, resíduos de pesticidas) e avaliar a ecologia nutricional 23,24,25,26,27,28,29 . Muitas abelhas se autolimpam quando confinadas em um recipiente. Portanto, métodos não letais de amostragem de pólen têm sido utilizados³⁰ (por exemplo, tubos de microcentrífuga). No entanto, nos casos em que a autolimpeza não ocorre, o uso de um recipiente mais tátil, como os sacos plásticos que podem ser fechados novamente usados neste protocolo, permite que uma leve pressão seja aplicada a partes específicas do corpo para que o pólen entre em contato com o saco plástico, levando a uma maior probabilidade de obter uma amostra de pólen do que o uso de recipientes rígidos tradicionais.

Aqui, apresentamos um protocolo que foi bem testado em três táxons de abelhas em risco. Embora trabalhoso, permite a coleta abrangente de dados de insetos polinizadores, minimizando a ameaça de mortalidade para os organismos individuais. O objetivo geral do uso dessa metodologia é fornecer um meio seguro e eficaz de capturar, identificar e liberar insetos com segurança. Uma vantagem adicional deste protocolo é que ele supera muitas das limitações da coleta tradicional de insetos. Ele fornece uma maneira fácil de marcar indivíduos, coletar material genético não letal e coletar amostras de pólen, minimizando o tempo de manuseio e o estresse do organismo. Embora os métodos tradicionais de coleta de insetos tenham muitos benefícios³¹, para ajudar a superar algumas de suas limitações, estabelecemos uma alternativa para que os insetos possam ser confinados para identificação antes de uma liberação rápida e segura. Dependendo dos objetivos do projeto, etapas adicionais também podem ser tomadas enquanto a abelha está confinada para coletar outros dados importantes.

Protocolo

1. Preparação da coleta de campo

1. Confirme os objetivos do projeto (por exemplo, identificação de organismos, amostragem de tecido genético, etc.).
2. Revise a Tabela de Materiais e reúna todos os itens relevantes específicos para os objetivos do projeto.
3. Certifique-se de que todos os equipamentos digitais (por exemplo, smartphone, câmera, sistema de posicionamento global portátil [GPS]) estejam totalmente carregados e que as baterias sobressalentes estejam carregadas e embaladas.

2. Captura e proteção do organismo

1. Registre os parâmetros do local de interesse ao chegar ao campo, incluindo data, hora de início, local/local do campo e qualquer outra informação relevante (por exemplo, condições climáticas, plantas dominantes de cobertura do solo, plantas em flor, etc.) que possam ser necessárias (Figura 1).
2. Capture uma abelha individual de interesse usando a técnica de rede apropriada. Use uma rede de mão por meio de uma rede aérea de insetos ou rede de varredura com base nas espécies focais.
   NOTA: Outras técnicas de captura, como coleta via frasco/tubo de centrífuga, também podem ser usadas para captura de insetos.
3. Observe visualmente o espécime através do saco de rede para determinar se ele se assemelha ao táxon de interesse. Caso contrário, libere a amostra com segurança e continue o levantamento.
4. Se o espécime parecer ser a espécie focal, prenda o espécime dentro do saco de rede de forma que ele não possa escapar (por exemplo, sobrepondo a parte superior do saco de rede sobre a estrutura, torcendo / confinando o gargalo do saco de rede ou fechando quaisquer saídas potenciais).
5. Reúna o saco de amostra que pode ser fechado novamente e abra o saco de amostra.
6. Certifique-se de que a abelha de interesse esteja perto da ponta do saco de rede.
7. Com uma mão, segure o saco de rede imediatamente abaixo da amostra. Segure o saco da rede de forma que a ponta (onde o inseto está confinado) fique orientada para cima e a abertura da rede (ou seja, aro) fique pendurada abaixo.
   NOTA: A maioria dos insetos é fototrófica e, quando confinados, geralmente voam / rastejam em direção à luz.
8. Usando a outra mão (ou seja, a mão que não segura o saco de rede), guie o saco de amostra que pode ser fechado novamente na abertura da rede e através do saco de rede até atingir a mão imediatamente abaixo da amostra.
9. Solte cuidadosamente a alça da mão, confinando a amostra apenas o suficiente para permitir que a mão que segura o saco de amostra que pode ser fechado novamente se mova para a área confinada com a amostra. Esteja atento à localização da amostra dentro da área confinada para reduzir a probabilidade de ser picado, machucar a amostra e escapar.
10. Manipule o saco de amostra que pode ser fechado novamente para abrir o suficiente para permitir a entrada da amostra do inseto. Faça isso aplicando pressão em ambos os lados do selo ou torcendo o saco com o polegar e o dedo médio abaixo do selo.
11. Posicione a abertura do saco de amostra que pode ser fechada novamente acima da amostra e manobre suavemente o inseto para dentro do saco. Como mencionado anteriormente, como a maioria dos insetos é fototrófica, oriente a mão que contém o saco de amostra que pode ser fechado novamente em direção ao sol/céu, facilitando assim o movimento da amostra para dentro do saco.
12. Assim que a amostra estiver dentro, feche firmemente o saco de amostra que pode ser fechado novamente.
13. Remova o saco de amostra que pode ser fechado novamente contendo a amostra da rede contra insetos.
    NOTA: Como os insetos podem superaquecer rápida e letalmente em sacos lacrados, mantenha a amostra longe da exposição direta ao sol, de preferência em um local sombreado ou recipiente isolado até o processamento, e limite o tempo de processamento.

3. Identifique o organismo

1. Inspecione de perto o espécime para confirmar que é um táxon de interesse. Se for uma espécie diferente, solte-a com segurança e continue pesquisando.
   NOTA: Para evitar danos à amostra, nunca aplique pressão direta no inseto enquanto ele estiver dentro da bolsa. As amostras podem ser imobilizadas aplicando uma leve pressão no plástico ou esticando o perímetro do saco para esticá-lo ao redor do espécime, limitando assim o movimento.
2. Se a identidade da espécie puder ser confirmada visualmente com facilidade e precisão, leve um voucher com foto (Figura 2). Registre qualquer informação adicional necessária sobre a amostra (por exemplo, hora da captura, localização GPS específica, planta visitada, marcações exclusivas, observação de tamanho ou coloração, comportamento antes da captura, etc.).
3. Se características físicas específicas precisarem ser inspecionadas para confirmar a identidade, tire fotografias macro detalhadas destacando essas características principais por meio do saco de amostra que pode ser fechado novamente (Figura 2).
4. Se fotos de qualidade suficiente para discernimento de características não puderem ser obtidas através do saco de amostra, exponha a(s) parte(s) do corpo da amostra de interesse para uma inspeção minuciosa, cortando uma das duas pontas de canto não seladas do saco de amostra (ou seja, os cantos que estão costurados ou não podem ser fechados novamente). Por exemplo, faça um pequeno orifício para expor apenas a cabeça, o abdômen ou a perna (Figura 3A-C). Para isso, manipule a amostra de forma que a parte do corpo de interesse se mova primeiro em direção ao orifício de corte/canto.
   NOTA: O tamanho e a posição do orifício cortado no saco e a orientação do inseto podem precisar ser alterados para obter a fotografia necessária.
5. Após a identificação, pule para as seções relevantes para os métodos subsequentes e desejados. Consulte a seção 4 para técnica de remoção do segmento antenal, a seção 5 para marcação de insetos e / ou a seção 6 para obter amostras de pólen.

4. Obtenção de amostras genéticas não letais de antenas

1. Use uma tesoura para cortar diagonalmente um dos dois cantos não selados (ou seja, os cantos que estão costurados ou não podem ser fechados novamente) do saco de amostra que pode ser fechado novamente. Certifique-se de que o corte feito seja minimamente maior que a largura da cabeça da abelha (Figura 4).
2. Manipule a amostra para que ela se mova de cabeça em direção ao orifício de corte/canto.
   NOTA: Esta etapa pode ser adaptada para coletar outras amostras de tecido para análise genética (por exemplo, perna inteira, perna parcial). Assim, o tamanho e a posição do orifício cortado no saco e a orientação do inseto podem precisar ser alterados para obter a amostra necessária.
3. Assim que a cabeça da abelha estiver saindo do saco, aplique pressão suavemente no plástico ao redor para esticá-lo ao redor do inseto, restringindo o movimento (Figura 3A).
4. Se o orifício for muito grande, role o saco sobre si mesmo para restringir ainda mais a abertura do orifício e prender a amostra. Se não tiver certeza do tamanho apropriado do furo, execute as etapas 4.2 e 4.3 dentro de uma rede de insetos ou gaiola de vôo para garantir que a amostra não escape totalmente. Use um saco adicional se o corte de canto original for muito grande.
5. Posicione o saco de forma que a cabeça do inseto fique diretamente sobre o recipiente de coleta (por exemplo, tubo de microcentrífuga / frasco contendo solução tampão / etanol) e que o recipiente para a amostra genética esteja devidamente marcado com o ID de amostra exclusivo correspondente a todos os outros dados de amostra (Figura 3D).
6. Usando uma tesoura de dissecação limpa e esterilizada, corte uma parte de um segmento antenal. Inspecione visualmente o recipiente para confirmar se a amostra está dentro do recipiente.
   NOTA: Ao cortar, é útil trabalhar sobre um substrato limpo, esterilizado e de cor clara (por exemplo, Kimwipe). Isso garante que, se a amostra não cair no recipiente de coleta de amostras, ela possa ser facilmente recuperada com uma pinça com risco mínimo de contaminação.
7. Fixe a tampa do recipiente de coleta de amostras de tecido e gire o recipiente de forma que a amostra fique suspensa dentro da solução (por exemplo, solução tampão/etanol).
8. Coloque o recipiente de coleta de amostras de tecido (com a amostra antenal) em um recipiente seguro, de preferência em um local fresco e sombreado, protegido da luz solar direta e/ou de temperaturas extremas, como um resfriador de campo.
9. Solte a amostra com segurança perto do ponto original de captura.
   NOTA: A amostra também pode ser marcada (consulte a seção 5) antes da liberação para identificá-la prontamente como tendo sido amostrada se for revistada / apreendida.

5. Marcando o organismo

1. Com a amostra no saco de amostra que pode ser fechado novamente, faça um pequeno orifício no meio do saco de amostra.
   NOTA: Este orifício é adicional ao orifício criado na seção 4. O buraco não deve ser maior que a área do tórax do inseto. A posição de onde o furo deve ser cortado pode variar de acordo com o tamanho do inseto e a área de marcação desejada.
2. Aplicando uma leve pressão no plástico em ambos os lados da amostra, manobre o inseto de forma que o tórax fique diretamente sob o orifício (ou seja, que a parte superior do tórax fique exposta através da bolsa). Continue com uma leve pressão para garantir que a amostra permaneça no lugar (Figura 5A).
   NOTA: Outras áreas de marcação podem ser melhores para certos insetos (Figura 5B). Alguns usuários acham mais útil aumentar o orifício existente (da seção 4) e agarrar a abelha segurando seu tórax à medida que ela emerge (Figura 5C). Essa abordagem pode aumentar a chance de ser picado. Além disso, os dispositivos de marcação de rainhas de abelhas podem ser modificados para confinar e marcar as abelhas se o usuário achar isso mais fácil. No entanto, esse método requer transferência para um dispositivo diferente e pode contaminar as amostras de pólen.
3. Usando uma caneta de marcação de tinta (ou outro material de marcação considerado apropriado para o táxon de interesse), marque a amostra de acordo com a metodologia específica do projeto predeterminada.
   NOTA: Os métodos de marcação serão diferentes com base nos objetivos e podem ser simples, indicando que o indivíduo foi capturado, ou complexos, permitindo a identificação de indivíduos (por exemplo, usando código de cores ou padrões exclusivos) (Figura 5C).
4. Segure a amostra no lugar até que a marca aplicada esteja adequadamente seca.
5. Fotografe o indivíduo marcado para confirmação da coloração e posição de cor únicas.
   NOTA: Os indivíduos recapturados podem ser fotografados de forma fácil e rápida diretamente através do saco de amostra que pode ser fechado novamente (Figura 5D).
6. Solte a amostra com segurança perto do ponto original de captura.

6. Coleta de amostras de pólen

1. Com a amostra no saco de amostra que pode ser fechado novamente, inspecione-o cuidadosamente quanto a pólen visível.
   NOTA: Como o tipo e a quantidade de pólen variam tremendamente, às vezes o pólen não é visível na amostra a olho nu. Se as etapas anteriores já foram concluídas, é possível que os restos de pólen da amostra já estejam na bolsa.
2. Se o pólen for visível na amostra, limite o movimento da amostra aplicando uma leve pressão no plástico em ambos os lados.
3. Usando um dedo, esfregue suavemente ou empurre o plástico contra as cerdas ou a parte do corpo contendo pólen para facilitar a remoção do pólen.
4. Se o pólen não for visível na amostra, maximize o contato entre a amostra e o plástico para ver se algum pequeno remanescente de pólen é removido do tegumento.
5. Confirme visivelmente se o pólen está no saco de amostra que pode ser fechado novamente, se possível (Figura 4).
6. Solte a amostra com segurança perto do ponto original de captura.
7. Feche firmemente o saco de amostra que pode ser fechado novamente contendo a amostra de pólen.
   NOTA: Se um orifício foi feito no saco de amostra que pode ser fechado novamente, ele deve ser colocado dentro de outro saco de amostra que pode ser fechado novamente para evitar contaminação ou perda de pólen.
8. Rotule o saco de amostra que pode ser fechado novamente com um ID de amostra exclusivo correspondente ao inseto individual e outros dados (por exemplo, ID da espécie de inseto, data, local, hora, sexo, registro de visitação floral, etc.).
9. Coloque o saco de amostra que pode ser fechado novamente com a amostra de pólen em um recipiente seguro, de preferência em um local mais fresco, para protegê-lo da luz solar direta e/ou temperaturas extremas.
   NOTA: Se apropriado, siga os protocolos específicos do projeto para preservação de pólen baseada em campo (por exemplo, análise genética, morfologia do pólen).

Resultados

Esta metodologia foi usada para três espécies de abelhas em risco (Osmia calaminthae, Caupolicana floridana e C. electa) no sudeste dos Estados Unidos. Até o momento, centenas de abelhas e vespas foram coletadas e liberadas com segurança. Nenhuma abelha morreu ao usar esta metodologia; aqueles designados como espécimes de voucher e mantidos como um novo registro de localização com a agência de gerenciamento apropriada foram sacrificados adequadamente após a coleta de dados. A Tabela 1 mostra diferentes características morfológicas avaliadas, bem como outros dados quantificáveis que podem ser coletados usando este protocolo 14,32,33,34,35,36.

Figura 1: Exemplo de folha de dados mostrando dados que podem ser coletados enquanto estiver em campo. Os dados específicos coletados variam de acordo com os objetivos do projeto. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 2: Fotos para servir como vouchers. Tirar fotos para servir como comprovantes da ocorrência é essencial para fins de relatório. Fotos de características de identificação distintas são necessárias quando várias espécies compartilham características semelhantes. Este Anthidium maculifrons encontrado na Flórida pode ser distinguido de outros do gênero com base no amarelo em seu escapo e cabeça. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 3: Colocando o orifício no saco de amostra que pode ser fechado novamente. A colocação do orifício no saco de amostra resselável pode ser alterada para que partes específicas do corpo de interesse sejam expostas para fotografias ou amostras genéticas. Nesta foto composta, a (A) cabeça da abelha, (B) abdômen e (C) perna são expostos à fotografia. Uma vez que a abelha está confinada e não pode se mover, ela geralmente descansa e pode ser posicionada para obter uma macrofotografia. (D) Uma amostra genética também pode ser coletada quando a abelha está nessas posições. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 4: Saco coletor com abelha mostrando um canto cortado diagonalmente. Se quiser observar de perto a cabeça da abelha, o corte no canto da bolsa varia de tamanho com base no tamanho da cabeça da abelha. Secreções de pólen e até mesmo de néctar podem ser encontradas na bolsa para futura identificação de pólen. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 5: Imagens de saco de amostra resselável com abelhas. Para evitar ser picado ao marcar a abelha, um orifício pode ser feito no saco e o tórax (A) pode ser posicionado sob o orifício. (B) Dependendo do tamanho da abelha, também pode ser marcado no abdômen. (C) Alternativamente, a abelha também pode ser liberada do orifício do canto e comprimida no tórax para marcação. Essa técnica pode aumentar a chance de ser picado, mas parece minimizar a mancha da caneta. Coloração/numeração exclusiva pode ser usada para diferenciar entre indivíduos. (D) Futuros espécimes recapturados podem ser fotografados de forma rápida e fácil através do saco de amostra que pode ser fechado novamente e liberado. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Tabela 1: Características morfológicas avaliadas usando este protocolo. As amostras também podem ser manipuladas para observar e documentar várias características não representadas nesta tabela (por exemplo, forma do tergito / esternito, comprimento total, peso, número de dentes, venação da asa, distância intertegular, etc.). Clique aqui para baixar esta tabela.

Discussão

Este protocolo descreve um método de campo para manusear e inspecionar com segurança abelhas raras com o objetivo final de obter amostras não letais desejadas ou informações de voucher e liberar com segurança indivíduos focais de volta à natureza no ponto original de captura. Os benefícios deste protocolo em relação a outros métodos de coleta, como o uso de frascos, são que a amostra pode ser confinada com segurança para permitir um exame minucioso das principais características e uma identificação confiável, limitando os danos ao inseto e ao investigador. Por outro lado, como ocorre com outras metodologias^18,19, esse protocolo não exige que o espécime seja anestesiado; Pode ser amostrado e liberado rapidamente com o mínimo de manuseio. Os sacos de amostra resseláveis são de baixo custo, fáceis de adquirir, leves, extremamente portáteis e recicláveis, tornando-os uma ótima alternativa aos tubos de centrífuga. Como eles não têm a rigidez de algumas alternativas (por exemplo, tubos de falcão ou outros recipientes rígidos), é importante tomar cuidado extra ao manusear espécimes de insetos vivos. Se uma amostra inteira for levada como comprovante, colocá-la em um invólucro resistente reduzirá os danos potenciais à amostra.

É benéfico para os pesquisadores que usam esse método ter experiência no manuseio de abelhas e/ou outros insetos, pois aplicar muita pressão sobre os espécimes enquanto eles estão no saco pode resultar em ferimentos ou mortalidade. Para obter mais experiência no manuseio de abelhas, pesquisadores novatos devem praticar este protocolo usando espécies mais comuns (por exemplo, abelhas). A prática ajudará a minimizar lesões ou mortalidade do inseto. É importante notar que, dependendo do táxon focal, pode haver limitações para esta metodologia. O tamanho reduzido de táxons específicos pode exigir o uso de equipamentos de macrofotografia mais caros e especializados e/ou o uso de microscópios de campo, pois suas características podem não ser capazes de ser isoladas e fotografadas com os materiais listados neste procedimento, quanto menor o alvo, mais difícil pode ser obter imagens adequadas³⁷. Além disso, nos casos em que partes do corpo inacessíveis são necessárias (por exemplo, língua, genitália, etc.), outros métodos de identificação podem ser justificados. A genitália está entre as características diagnósticas mais informativas para insetos, que podem ser altamente variáveis entre as espécies e um tanto estáveis dentro delas^38,39. Nesse caso, métodos letais, como dissecação, podem ser necessários. No entanto, para espécies difíceis de identificar, o uso de amostras genéticas pequenas e não letais pode ser usado para identificação após a coleta de campo⁴⁰, e a metodologia descrita aqui pode ser usada para coletar essas amostras. A modelagem estatística também está sendo desenvolvida para ajudar a associar imagens e sequenciamento de DNA para identificação de insetos⁴¹.

Outra limitação da metodologia aqui apresentada diz respeito à probabilidade de ser picado ao realizar esse protocolo, principalmente quando se tem um furo cortado na bolsa. Este protocolo, no entanto, minimiza a probabilidade de ser picado; Os autores raramente foram picados em sacos de amostras durante o manuseio de amostras. Deve-se notar também que algumas espécies de abelhas, besouros e vespas foram capazes de cortar os sacos usando suas mandíbulas, portanto, deve-se ter cuidado ao determinar se essa abordagem funcionará para os táxons de interesse e, nesses casos, sacos plásticos mais grossos ou outras metodologias seriam recomendados. Em todos os casos, os usuários devem minimizar o uso de plásticos de uso único e reciclar quando possível.

O táxon focal para o desenvolvimento deste protocolo foi a abelha calamintha azul, Osmia calaminthae (Hymenoptera: Megachilidae), que mede aproximadamente 10-11 mm no tamanho³². Desde o desenvolvimento deste método, os autores o empregaram em uma variedade de outros himenópteros de vários tamanhos, incluindo espécies maiores de Bombus (Hymnenoptera: Apidae) e espécies de Caupolicana , C. electa e C. floridana (Hymenoptera: Colletidae). Caupolicana electa pode variar de 18-23 mm, enquanto C. floridana pode variar de 16-18 mm³³. Para ajudar a minimizar quaisquer impactos negativos para espécies em risco, ameaçadas ou listadas, é recomendável experimentá-lo primeiro em substitutos intimamente relacionados e/ou comuns para ajudar a ganhar experiência e desenvolver proficiência. O exoesqueleto de abelhas e outros insetos pode variar, e espécimes menos robustos devem ser tratados com cuidado. Em situações em que corpos menores ou mais moles de insetos estão sendo estudados, essa metodologia pode não ser suficiente. Os usuários devem determinar quais partes dessa metodologia serão apropriadas para seu táxon focal.

Além do objetivo principal de confinar organismos coletados em campo para identificação, este protocolo pode ser modificado para realizar várias tarefas relacionadas à pesquisa para as quais as abelhas precisam ser confinadas com segurança. Por exemplo, os organismos podem ser pesados no campo enquanto estão nos sacos de amostra que podem ser fechados novamente. Os pesquisadores também podem fazer várias medições de espécimes usando paquímetros enquanto o inseto está constrangido. Por exemplo, a estimativa da capacidade de homing das abelhas pode ser feita usando o tamanho do corpo⁴²; Nossa metodologia pode ajudar a adquirir dados que facilitem essa estimativa. Da mesma forma, em vez de usar paquímetros, os pesquisadores podem colocar e fotografar uma régua / barra de escala e / ou cartão de cor diretamente atrás da amostra para medir as principais características morfológicas ao processar imagens posteriormente. Aplicações futuras desse método podem alavancar avanços em inteligência artificial e aprendizado de máquina. A identificação, tanto no campo quanto no laboratório, pode ser simplificada usando dispositivos inteligentes, minimizando assim o tempo de manuseio e o estresse nas amostras.

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
30x 60x illuminated jewelers eye loupe magnifier	JARLINK		Hand lens (if necessary) for observing diagnostic characteristics
Aerial hand net
Bleech in wash bottle			Only needed for non-lethal genetic sampling
Blunt-tip kids scissors	Fiskar		Blunt-tip scissors are beneficial because they can safely be kept in pockets
Ethanol in wash bottle			Only needed for non-lethal genetic sampling
FD-1 flash diffuser	Olympus		Flash Diffuser to illuminate specimen while taking voucher photos
Field clipboard
Field cooler
Fine forceps
Fine point oil-based paint marker set	Sharpie		Pens to mark bees
Kimwipes	Kimtech
Microcentrifuge tubes			Only needed for non-lethal genetic sampling
Resealable sample bag	Amazon		Dependent on specimen of interest. We prefer 50.8 mm x 76.2 mm or 50.8 mm x 50.8 mm  - Edvision 2" x 3" Plastic Bags, 200 Count 2 Mil Transparent Resealable Zipper Poly Bags, Reclosable Storage Bags for Jewelry Supplies, Beads, Screws, Small Items  - Soft 'N Style 500 Count Resealable Zipper Poly Bags, 2 by 2-Inch, 50mm by 50mm, Clear
Stainless steel iris dissecting scissors			More precise than blunt-tipped scissors.  Should be kept in a secure location.
TG-7 or similar camera	Olympus		Camera with macro setting to take voucher photos