Determinando a estabilidade sérica da enzima adenosina desaminase 1 humana

Resumo

Neste artigo, detalhamos métodos para caracterizar a capacidade de uma enzima de reter a função quando incubada a 37 ° C no soro humano, uma propriedade farmacológica conhecida como estabilidade sérica. Essa capacidade pode ser um fator chave na previsão do perfil farmacocinético de uma enzima e sua adequação para uso terapêutico.

Resumo

O conceito de estabilidade enzimática é normalmente usado para se referir à termoestabilidade de uma enzima - sua capacidade de reter estrutura e atividade à medida que a temperatura aumenta. Para uma enzima terapêutica, outras medidas de estabilidade também podem ser críticas, particularmente sua capacidade de reter a função no soro humano a 37 ° C, que chamamos de estabilidade sérica. Aqui, descrevemos um ensaio in vitro para avaliar a estabilidade sérica da enzima Homo sapiens adenosina desaminase I (HsADA1) do tipo selvagem usando um procedimento de microplaca baseado em absorbância. Especificamente, este manuscrito descreve a preparação de tampões e reagentes, um método que organiza a coincubação de HsADA1 no soro, um método para analisar as amostras de teste usando um leitor de microplacas e uma análise de acompanhamento para determinar a fração de atividade que uma enzima HsADA1 retém no soro em função do tempo. Discutimos ainda considerações para adaptar este protocolo a outras enzimas, usando um exemplo de uma enzima Homo sapiens quinurenase, para ajudar na adaptação do protocolo a outras enzimas onde a estabilidade sérica é de interesse.

Introdução

O método a seguir permite que um usuário avalie quantitativamente a capacidade de uma enzima de reter sua atividade quando exposta a condições que imitam o que ela encontrará após a injeção intravenosa. O método in vitro imita essas condições in vivo e consiste na incubação da enzima em soro humano agrupado a 37 °C e análises temporais da retenção da atividade enzimática. Referimo-nos à capacidade de uma enzima de reter atividade nessas condições como sua estabilidade sérica, e o método de análise da atividade enzimática aproveita as diferenças na absorbância entre o substrato de uma enzima e o produto resultante. O ....

Protocolo

1. Incubação de soro

1. Prepare um estoque de 10x de HsADA1 em 1x PBS pH 7,4 (1x PBS) a uma concentração final de 10 μM. Descongele uma alíquota de 15 mL de soro humano agrupado e pré-aqueça a 37 ° C. Pré-aqueça uma alíquota de 50 mL de 1x PBS a 37 °C.
2. Preparar as misturas de incubação enzima-soro adicionando 100 μL do stock 10x HsADA1 a 900 μL de soro humano agrupado num tubo de microcentrífuga de baixa ligação, denominado mistura enzima + soro. Em um tubo de microcentrífuga de baixa ligação separado, adicione 100 μL do estoque 10x HsADA1 a 900 μL de 1x PBS para comparação com um controle sem soro, ....

Discussão

Este protocolo usa a mudança de absorbância à medida que o substrato é convertido no produto para medir a atividade de uma enzima. Como tal, o substrato e o produto devem ter perfis espectrais distintos. Este é o caso da adenosina e da inosina, ambas com perfis espectrais distintos e coeficientes de extinção entre 260-265 nm 6,8,12,13. Este ensaio é ins.......

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Adenosine	Sigma Aldrich	A9251-25G	25 g
BioTek Synergy HT Microplate Reader
Eppendorf LoBind Microcentrifuge Tubes: Protein	Fisher Scientific	13-698-795	2 mL
Glycerol	Fisher Scientific	G33-4	4 L
HsKYNase66-W102H-T333N	In-house
Human Serum, Pooled	MP Biomedicals	92931149	100 mL
Hydroxy-kynurenine	Cayman Chemicals	27778
Inosine	TCI	I0037	25 g
PBS, 1x  pH 7.4+/- 0.1	Corning	21-040-CM
Pyridoxal 5-phosphate monohydrate, 99%	Thermo Scientifc	228170010	1 g
UV-STAR MICROPLATE, 96 WELL, COC, F-BOTTOM	Greiner Bio	655801
Wildtype Human Adenosine Deaminase 1	In-house