Avaliação da liberação de LC3-II via vesículas extracelulares em relação ao acúmulo de vesículas intracelulares positivas para LC3

Resumo

Aqui, apresentamos a metodologia para avaliar de forma concisa os níveis de LC3-II do marcador autofagossomo em vesículas extracelulares (EVs) por immunoblotting. A análise dos níveis de LC3-II em EVs, formação de autolisossomos e formação de ômegassomos sugere o novo papel de STX6 na liberação de EVs positivos para LC3-II quando a fusão autofagossomo-lisossomo é inibida.

Resumo

A (macro)autofagia representa uma via fundamental de degradação celular. Nesse processo, vesículas de membrana dupla conhecidas como autofagossomos engolfam o conteúdo citoplasmático, fundindo-se posteriormente com os lisossomos para degradação. Além do papel canônico, os genes relacionados à autofagia também modulam uma via secretora envolvendo a liberação de moléculas inflamatórias, fatores de reparo tecidual e vesículas extracelulares (EVs). Notavelmente, o processo de disseminação de proteínas patológicas entre as células, particularmente em doenças neurodegenerativas que afetam o cérebro e a medula espinhal, ressalta a importância de entender esse fenômeno. Pesquisas recentes sugerem que a proteína de ligação ao DNA de resposta transativa 43 kDa (TDP-43), um jogador-chave na esclerose lateral amiotrófica e na degeneração lobar frontotemporal, é liberada de maneira dependente da autofagia por meio de EVs enriquecidas com as proteínas associadas aos microtúbulos marcadores autofagossômicos 1A / 1B de cadeia leve 3B-II (LC3-II), especialmente quando a fusão autofagossomo-lisossomo é inibida.

Para elucidar o mecanismo subjacente à formação e liberação de EVs positivas para LC3-II, é imperativo estabelecer um método acessível e reprodutível para avaliar vesículas positivas para LC3-II intracelulares e extracelulares. Este estudo apresenta um protocolo detalhado para avaliação dos níveis de LC3-II via immunoblotting em frações celulares e EV obtidas por centrifugação diferencial. A bafilomicina A1 (Baf), um inibidor da fusão autofagossomo-lisossomo, serve como um controle positivo para aumentar os níveis de vesículas positivas para LC3-II intracelulares e extracelulares. O gene de suscetibilidade tumoral 101 (TSG101) é usado como marcador para corpos multivesiculares. Aplicando este protocolo, demonstra-se que o knockdown da sintaxina-6 mediado por siRNA (STX6), um fator de risco genético para a doença de Creutzfeldt-Jakob esporádica, aumenta os níveis de LC3-II na fração EV de células tratadas com Baf, embora não mostre efeito significativo nos níveis de TSG101. Esses achados sugerem que o STX6 pode regular negativamente a liberação extracelular de LC3-II via EVs, particularmente sob condições em que a fusão autofagossomo-lisossomo é prejudicada. Combinado com métodos estabelecidos para avaliar a autofagia, este protocolo fornece informações valiosas sobre o papel de moléculas específicas na formação e liberação de EVs positivos para LC3-II.

Introdução

A proteína de ligação ao DNA 43 (TDP-43) é uma ribonucleoproteína nuclear heterogênea amplamente expressa, envolvida na regulação do splicing de exons, transcrição gênica e estabilidade de mRNA, todas vitais para a sobrevivência celular ^1,2. Em condições neurodegenerativas como esclerose lateral amiotrófica (ELA) e degeneração lobar frontotemporal (FTLD), uma proteína nuclear TDP-43 se acumula anormalmente no citoplasma. Essa mudança resulta em uma perda da função do TDP-43 no núcleo e um ganho tóxico de função no citoplasma. O acúmulo patológico de TDP-43 começa em regiões específicas do cérebro e da medula espinhal, espalhando-se por essas áreas de forma semelhante a um príon, um processo intimamente associado à progressão da doença³. No entanto, o mecanismo exato pelo qual a patologia TDP-43 se espalha pelo cérebro e pela medula espinhal permanece desconhecido.

O TDP-43 é secretado através de vesículas extracelulares (EVs), e níveis elevados de TDP-43 são detectados no plasma e no líquido cefalorraquidiano (LCR) de pacientes com ELA e FTLD-TDP ^4,5,6. O LCR de pacientes diagnosticados com ELA e FTLD induz a má localização intracelular e a agregação de TDP-43 endógeno em células de glioma humano⁷. Assim, o TDP-43 liberado extracelularmente via EVs pode mediar a disseminação célula a célula da patologia TDP-43.

A autofagia é um mecanismo de degradação celular bem preservado que envolve o invólucro de substâncias indesejadas dentro de vesículas de membrana dupla, conhecidas como autofagossomos, que são marcadas por LC3. Esses autofagossomos se fundem com lisossomos positivos para proteína de membrana 1 associada a lisossomos (LAMP1) para formar autolisossomos (LC3⁺/LAMP1⁺), levando à degradação de seu conteúdo⁸. Análises histológicas indicam que autofagossomos que englobam inclusões se acumulam nos neurônios de pacientes esporádicos com ELA⁹. Alguns genes causais de ELA familiar e FTLD-TDP estão ligados à regulação da autofagia 10,11,12. Esses achados sugerem que a autofagia é suprimida em pacientes com ELA e FTLD-TDP.

O estudo anterior indicou que o TDP-43 é secretado via EVs positivos para o marcador de autofagossomo LC3-II quando a fusão autofagossomo-lisossomo é inibida¹³. A desregulação da via autofagia-lisossomo pode causar não apenas o acúmulo intracelular de TDP-43, mas também a liberação extracelular de TDP-43 via EVs¹⁴. No entanto, ainda não se sabe como os EVs positivos para LC3-II são liberados e quão significativo isso é na disseminação da patologia TDP-43.

Os EVs são classificados em EVs grandes (100 a 1000 nm de diâmetro), que são produzidos a partir do brotamento da superfície celular, e EVs pequenos (50 a 150 nm de diâmetro), que são produzidos a partir do brotamento das membranas endossômicas em direção ao interior do endossomo (conhecido como exossomos) e o aparelho de Golgi. Para coletar separadamente EVs grandes e pequenos, realizamos centrifugação sequencial e coletamos pellets por centrifugação a 20.000 × g e 110.000 × g, respectivamente. A fração P1 EV (pellets de 20.000 × g ) está preparada para coletar EVs grandes, e a fração EV P2 (pellets de 110.000 × g ) está preparada para coletar EVs pequenos¹⁵. A metodologia para avaliar os níveis de CL3-II em EVs grandes e pequenas derivadas da centrifugação sequencial por immunoblotting é estável e reprodutível¹⁶. Além de analisar os níveis de LC3-II em EVs, a análise da formação de autolisossomos e ômegassomos aumenta a compreensão de como a desregulação da autofagia leva à liberação de EVs positivos para LC3-II. Aqui, o presente estudo mostra o papel supressor da sintaxina 6 (STX6), uma proteína SNARE, que promove o movimento de vesículas de transporte para membranas-alvo¹⁷, na liberação de EVs positivos para LC3-II quando a fusão autofagossomo-lisossomo é inibida.

Protocolo

1. Preparação da célula, fração P1 e P2 EV do meio cultivado de células HeLa

1. Preparação da fração P1 e P2 EV a partir do meio cultivado de células HeLa
   1. Dia 1
      1. Conte as células usando um contador de células e semeie 1 × 10⁶ células em uma placa de 6 cm contendo um meio de cultura composto de DMEM High Glucose, 10% FBS e 1% de penicilina/estreptomicina. Incubar as células a 37 °C com 5% de CO₂ e humidade controlada durante 24 h.
   2. Dia 2 (opcional)
      1. Preparar uma solução de siRNA a 20 μM.
      2. Misture 100 μL de meio sérico reduzido e 3 μL de siRNA em um tubo de baixa retenção para preparar a solução A.
      3. Misture 100 μL de meio sérico reduzido e 5 μL de reagente de transfecção em um tubo de baixa retenção para preparar a solução B.
      4. Misture a solução A e a solução B e, em seguida, incube a mistura à temperatura ambiente (RT) por 5 min.
      5. Adicione a mistura das soluções A e B ao meio usado para cultivar células HeLa. Incubar as células a 37 °C com 5% de CO₂ e humidade controlada durante 24 h.
   3. Dia 3
      1. Lave as células com PBS e exponha-as a 500 μL de tripsina a 0,25% e solução de EDTA 1 mM a 37 °C com CO_{5% 2} e umidade controlada por 5 min.
      2. Adicione 2,5 mL do meio de cultura às células e use uma pipeta de transferência Pasteur com uma ponta de pipeta de 200 μL acoplada para preparar uma suspensão de célula única.
      3. Conte as células usando um contador de células e semeie 1 × 10⁶ células em uma placa de 10 cm. Incubar as células a 37 °C com 5% de CO₂ e humidade controlada durante 24 h.
         NOTA: É necessário preparar pelo menos 1 × 10⁶ células para coletar EVs do meio de cultura necessário para a análise de immunoblotting.
   4. Dia 4
      1. Preparar o meio de cultura (ver passo 1.1.1.1) contendo veículo (DMSO) ou Bafilomicina A1 100 nM (Baf).
      2. Expor as células ao meio que contém veículo ou 100 nM Baf e incubá-las a 37 °C com 5% de CO₂ e humidade controlada durante 24 h.
   5. Dia 5
      1. Recolha todo o meio de cultura da placa de 10 cm, transfira-o para um tubo de 15 ml e centrifugue-o a 3.000 × g durante 10 min a 4 °C para remover os restos celulares.
         NOTA: As células restantes na placa de 10 cm serão usadas na seção 1.2.1.
      2. Para o isolamento da fracção P1 EV, transferir o sobrenadante após centrifugação a 3 000 × g para um tubo de centrifugação e, em seguida, centrifugá-lo a 20 000 × g a 4 °C durante 1 h.
      3. Para o isolamento da fracção P2 EV, transferir o sobrenadante após centrifugação a 20.000 × g para um tubo de ultracentrifugação e, em seguida, centrifugá-lo a 110.000 × g a 4 °C durante 1 h.
      4. Depois de limpar o excesso de umidade dentro do tubo com um lenço de laboratório, ressuspenda os pellets restantes no tubo de centrifugação em 50 μL de tampão de amostra 2x [2,5% SDS, tampão Tris-HCl 125mM (pH 6,8), 30% glicerol, 10% 2-mercaptoetanol, 0,4% Azul de Bromofenol] para preparar a fração P1 EV.
      5. Remova o sobrenadante por decantação, limpe o excesso de umidade dentro do tubo com um lenço de laboratório e, em seguida, ressuspenda os grânulos restantes no tubo de ultracentrifugação em 50 μL de tampão de amostra 2x para preparar a fração P2 EV.
      6. Incubar as frações EV P1 e P2 a 100 °C num bloco de calor durante 10 min.
         NOTA: Não agite os tubos após centrifugação a 20.000 × g e 110.000 × g para evitar descartar acidentalmente os pellets restantes. Depois de inclinar o tubo para transferir o sobrenadante, mantenha a posição do tubo para evitar que o pellet seja novamente imerso no sobrenadante restante.
2. Preparação da fracção celular a partir de células HeLa cultivadas
   1. Dia 5
      1. Após a transferência do meio de cultura da placa de 10 cm para um tubo de 15 ml, lavar as células na placa de 10 cm com PBS e expô-las a 2 ml de tripsina a 0,25% e 1 mM de solução de EDTA a 37 °C com 5% de CO₂ e humidade controlada durante 5 min.
      2. Adicione 8 mL de meio de crescimento às células e, em seguida, use uma pipeta de transferência Pasteur com uma ponta de pipeta de 200 μL para pipetar as células e preparar uma suspensão unicelular.
      3. Transferir a suspensão celular para um tubo de 15 ml e centrifugar a 1.000 × g durante 10 min a 4 °C.
      4. Remova o sobrenadante por um aspirador, adicione PBS ao pellet da célula e centrifugue a 1.000 × g por 5 min a 4 ° C.
      5. Remova o PBS usando um aspirador e sonice o pellet celular em 1 mL de tampão A68 [tampão Tris-HCl 10 mM, pH 7,5, NaCl 0,8 M, 1 mM de etilenoglicol bis (éter β-aminoetílico) -N, N, N, N-ácido tetracético (EGTA)] contendo 1% de sarkosil.
      6. Meça a concentração de proteína do lisado celular usando um kit de ensaio de proteína BCA.
      7. Misture 300 μL do lisado celular com 100 μL de tampão de amostra 4x e incube a mistura a 100 ° C em um bloco de calor por 10 min para preparar a fração celular.

2. Análise de immunoblotting

1. Separar quantidades equivalentes de proteínas nas amostras por SDS-PAGE¹⁸.
2. Transfira as proteínas separadas para as membranas de difluoreto de polivinilideno (PVDF).
3. Após a transferência, bloqueie as membranas com o agente bloqueador por 20 min.
4. Incube a membrana bloqueada durante a noite com o anticorpo primário indicado em tampão Tris contendo 10% (v/v) de soro de bezerro em RT.
5. Lave a membrana com tampão Tris por 5 s e depois incube-a com um anticorpo secundário conjugado com biotina em RT por 2 h.
6. Lave a membrana com tampão Tris por 5 s e, em seguida, incube-a com tampão Tris contendo 0,4% (v / v) das soluções A e B do kit em RT por 1 h.
7. Lave a membrana com PBS e, em seguida, incube-a com PBS contendo 0,04% (p / v) de diaminobenzidina, 0,8% (p / v) de NiCl₂ · 6H₂O e 0,3% (v / v) H₂O₂ para detecção colorimétrica de bandas.
   NOTA: Para a detecção de sinais, um método de quimioluminescência também é aceitável.
8. Digitalize a imagem da membrana por um scanner e submeta-a à análise de densitometria usando Fiji.
   1. Abra a imagem digitalizada usando Fiji e converta a imagem colorida RGB em uma imagem de 8 bits clicando em Imagem | Tipo | 8 bits.
   2. Clique na ferramenta retângulo e ajuste o tamanho do retângulo arrastando-o para cercar as faixas. Identifique a banda a ser analisada clicando em Analisar | Géis | Selecione Primeira faixa.
   3. Posicione o retângulo na segunda banda e nas subsequentes e identifique as bandas para análise clicando em Analisar | Géis | Selecione Próxima faixa.
   4. Depois de reconhecer a banda final, meça a densitometria no retângulo clicando em Analisar | Géis | Traçar pistas.
   5. Cerque a área do sinal da banda com uma linha reta, clique na ferramenta varinha e clique na área para calcular a intensidade do sinal da banda.

3. Análise do número de autofagossomos e autolisossomos

1. Dia 1
   1. Conte o número de células HeLa usando um contador de células e semeie 1 × 10⁵ células HeLa expressando LAMP1-GFP e mCherry-LC3 em um prato de 3,5 cm. Incubar as células a 37 °C com 5% de CO₂ e humidade controlada durante 24 h.
2. Dia 2 (opcional)
   1. Execute os passos descritos na seção 1.1.2 em pratos de 3,5 cm.
3. Dia 3
   1. Descarte o meio de cultura dos pratos de 3,5 cm.
   2. Lave as células com PBS, exponha-as a 400 μL de tripsina a 0,25% e solução de EDTA 1 mM e incube a 37 ° C com 5% de CO₂ e umidade controlada por 5 min.
   3. Adicione 1,6 mL do meio de crescimento às células e pipete-as com uma pipeta de transferência Pasteur para preparar uma suspensão unicelular.
   4. Conte o número de células usando o contador de células e semeie 1 × 10⁴ células em uma lamínula de 8 câmaras. Incubar as células a 37 °C com 5% de CO₂ e humidade controlada durante 24 h.
      NOTA: Dois poços da lamínula com câmara são preparados para células de controle e knockdown STX6, respectivamente, após o tratamento com DMSO ou Baf, conforme descrito na seção 3.4.2.
4. Dia 4
   1. Prepare o meio de crescimento sem vermelho de fenol (DMEM sem vermelho de fenol, 10% de FBS, 1% de penicilina/estreptomicina), contendo veículo (DMSO) ou 100 nM de Baf dissolvido em DMSO.
   2. Substituir o meio de cultura pelo meio sem vermelho de fenol, contendo veículo ou 100 nM Baf, e incubar durante 4 h.
      NOTA: Para avaliar o efeito de Baf nos números de autofagossomas e autolisossomas, prepare células tratadas com veículo como controles.
   3. Manchar os núcleos com 0,33 μg/ml Hoechst 33342 durante 30 min antes da observação.
   4. Realize imagens de células vivas usando uma lente objetiva de 60x em um microscópio confocal a laser e capture dez quadros diferentes.
      1. Abra a imagem mesclada RGB em Fiji e divida-a nos respectivos componentes de imagem vermelho, verde e azul clicando em Imagem | Cor | Canais divididos.
      2. Defina um limite constante para os sinais vermelho e verde em cada imagem clicando em Imagem | Ajustar | Limite para cada experimento.
      3. Conte o número de áreas positivas para sinais vermelhos ou verdes clicando em Analisar | Analisar partículas. Marque a caixa Resumir e clique em OK. Registre os valores da contagem para identificar vesículas associadas a autofagossomos e lisossomos.
      4. Para sobrepor a imagem verde à imagem vermelha, defina o modo de transferência como E clicando em Editar | Controle de colagem. Copie a imagem verde e cole-a na imagem vermelha para mesclá-las, destacando as áreas que são positivas para sinais vermelhos e verdes.
      5. Para identificar números de autolisossomos, conte o número de áreas positivas para sinais vermelho e verde clicando em Analisar | Analisar partículas. Marque a caixa Resumir , clique em OK e registre os valores na seção Contagem para identificar vesículas associadas a autofagossomos e lisossomos.
   5. Divida o número total de autolisossomos e autofagossomos pelo número total de células para calcular o número de autolisossomos e autofagossomos por célula.
      NOTA: Conte pelo menos 35 células em cada um dos três experimentos independentes.

4. Análise para a formação de óssomas

1. Dia 1
   1. Conte o número de células HeLa usando um contador de células e semeie 1 × 10⁵ células em um prato de 3,5 cm. Incubar as células a 37 °C com 5% de CO₂ e humidade controlada durante 24 h.
2. Dia 2 (opcional)
   1. Execute as etapas descritas na seção 1.1.2.
3. Dia 3
   1. Preparar uma suspensão unicelular conforme descrito nos passos 3.3.1 a 3.3.2.
   2. Conte as células usando o contador de células e semeie 1 × 10⁵ células em um prato de 3,5 cm. Incubar as células a 37 °C com 5% de CO₂ e humidade controlada durante 24 h.
4. Dia 4
   1. Misture 1 μg de pEGFP-C1-hAtg13, 3 μL do reagente de transfecção de DNA e 100 μL de meio de soro reduzido em um tubo de baixa retenção. Incube a mistura por 20 min e adicione-a ao meio cultivado.
   2. Incubar as células a 37 °C com 5% de CO₂ e humidade controlada durante 24 h.
5. Dia 5
   1. Tripsinize as células conforme descrito nas etapas 3.3.1-3.3.2.
   2. Adicione 2,5 mL do meio de crescimento às células. Pipetar a mistura utilizando uma pipeta de transferência Pasteur para preparar uma suspensão unicelular.
   3. Conte as células usando o contador de células e semeie 1 × 10⁴ células em uma lamínula de 8 câmaras. Incubar as células a 37 °C com 5% de CO₂ e humidade controlada durante 24 h.
6. Dia 6
   1. Siga as etapas 3.4.1-3.4.4 para realizar imagens de células vivas das células da etapa 4.5.3 usando um microscópio confocal a laser. Capture dez quadros diferentes de imagens.
      1. Siga as etapas 3.4.4.1-3.4.4.3 para dividir as imagens mescladas RGB nos respectivos componentes de imagem vermelho, verde e azul, defina um limite constante para os sinais verdes em cada imagem e determine a intensidade do sinal GFP. Registre os valores da seção Área Total para determinar a intensidade do sinal de GFP-ATG13.
      2. Divida a intensidade total do sinal pelo número de células examinadas para calcular a intensidade do sinal por célula.
         NOTA: Conte pelo menos 34 células em cada um dos três experimentos independentes.

Resultados

Como mostrado em estudos anteriores, o tratamento com Baf aumentou os níveis de TSG101 (P1: P < 0,01, P2: P = 0,012, conforme determinado por ANOVA de duas vias em EZR¹⁹) e LC3-II (P1: P < 0,01, P2: P < 0,01, conforme determinado por ANOVA de duas vias em EZR¹⁹) na fração rica em EV. Notavelmente, o tratamento com Baf também aumentou os níveis de STX6 (P1: P < 0,01, P2: P < 0,01, conforme determinado por ANOVA de duas vias em EZR

Discussão

O estudo de immunoblotting revelou os níveis de LC3-II e TSG101 na fração celular, na fração P1 EV rica em microvesículas e na fração P2 EV rica em exossomos. A imagem de células vivas foi usada para examinar autofagossomos, autolisossomos e ômegassomos, fornecendo informações sobre se o knockdown de STX6 influencia a autofagia. Esses resultados combinados sugerem que o knockdown de STX6 afeta a liberação de EVs positivos para LC3-II, potencialmente ligado...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.25 % Trypsin EDTA	Fujifilm Wako	201-16945
10 cm Dish	Thermo Fisher Scientific	150464
15 mL Tube	Thermo Fisher Scientific	339650
200 μL Pipette Tip	Nippon Genetics	FG-301	pipetting
2-Mercaptoethanol	Nacalai Tesque	21417-52	a material for sample buffer solution
3,3'-Diaminobenzidine Tetrahydrochloride	Nacalai Tesque	11009-41	a material for DAB solution
3.5 cm Dish	Thermo Fisher Scientific	150460
6 cm Dish	TrueLine	TR4001
Aluminium Block Thermostatic Baths (dry thermobaths)	EYELA	273860
Aspirator	SANSYO	SAP-102	inhaling solution
Avanti JXN-30	Beckman Coulter	B34193
Bafilomycin A1	Adipogen	BVT-0252
Biotin-conjugated Goat Anti-rabbit IgG Antibody	Vector Laboratories	BA-1000	2nd antibody for immunoblotting
Biotin-conjugated Horse Antimouse IgG Antibody	Vector Laboratories	BA-2000	2nd antibody for immunoblotting
Blocking One	Nacalai Tesque	03953-95	a material for immunoblotting
Bromophenol Blue	Nacalai Tesque	05808-61	a material for sample buffer solution
Calf Serum	cytiva	SH30073.03
CanoScan LiDE 220	Canon	CSLIDE220	Scanner
Centrifuge 5702 R	eppendolf	5703000039
Counting Slides Dual Chamber	Bio-Rad	1450015J	cell counting
Digital Sonifier 450	BRANSON
Dimethyl Sulfoxide	nacalai tasque	09659-14	vehicle
DMEM High Glucose	Nacalai Tesque	08458-45	culture medium
DMEM without Phenol Red	Nacalai Tesque	08489-45	culture medium
EGTA	Dojindo	348-01311	a material for A68 solution
Excel	Microsoft	version 16.16.27	satistical analysis
EZR	Reference No. 24	version 1.68	satistical analysis
FBS	Sigma	173012	Culture medium
Fiji	NIH		Image analysis tool
Glycerol	Nacalai Tesque	09886-05	a material for sample buffer solution
Hoehst33342	Dojindo	H342
Hydrogen Peroxide	Fujifilm Wako	080-0186	a material for DAB solution
Kimwipe S-200	NIPPON PAPER CRECIA	62011	cleaning wipe
Low Retention Tube	Nippon Genetics	FG-MCT015CLB	siRNA and DNA transfection
LSM780 Confocal Laser Microscope	Carl Zeiss
Monoclonal Mouse Anti-LC3 Antibody	MBL	M186-3	1st antibody for immunoblotting
Nickel(II) Chloride Hexahydrate	Fujifilm Wako	149-01041	a material for DAB solution
N-Lauroylsarcosine Sodium Salt	Nacalai Tesque	20117-12
Optima XE-90 Ultracentrifuge	Beckman Coulter	A94471
Opti-MEM I Reduced Serum Medium	Thermo Fisher Scientific	31985-070	siRNA and DNA transfection
pEGFP-C1-hAtg13	Addgene	22875
Penicillin/Streptomycin	Nacalai Tesque	26253-84	Culture medium
Pierce BCA Protein Assay Kits	Thermo Fisher Scientific	23225
Polyclonal Rabbit Anti-PCNA Antibody	BioAcademia	70-080	1st antibody for immunoblotting
Polyclonal Rabbit Anti-syntaxin 6 Antibody	ProteinTech	10841-1-AP	1st antibody for immunoblotting
Polyclonal Rabbit Anti-TSG101 Antibody	ProteinTech	28283-1-AP	1st antibody for immunoblotting
Polyclonal Rabbit Anti-ULK1 Antibody	ProteinTech	20986-1-AP	1st antibody for immunoblotting
Polyvinylidene Difluoride Membrane	Milliore	IPVH00010	a material for immunoblotting
R	R development core team	version 4.4.1	satistical analysis
RNAiMAX	Thermo Fisher Scientific	13778	siRNA transfection reagent
siRNA STX6	Thermo Fisher Scientific	HSS115604	siRNA for transfection
Sodium Chloride	Nacalai Tesque	31320-05	a material for Tris buffer and A68 solution
Sodium Dodecyl Sulfate	Fujifilm Wako	192-13981	a material for sample buffer solution
SPARK Microplate Reader	TECAN
Stealth RNAi Negative Control Duplexes, Med GC	Thermo Fisher Scientific	12935300	siRNA transfection
Sucrose	Fujifilm Wako	193-00025	a material for A68 solution
TC20 Automated Cell Counter with Thermal Printer	Bio-Rad	1450109J1	cell counting
Thermobath	TOKYO RIKAKIKAI	MG-3100	incubation
TransIT-293	Mirus Bio	MIR 2700	DNA transfection reagent
TransIT-LT1	Mirus Bio	MIR2300	DNA transfection reagent
Tris(hydroxymethyl)aminomethane	Nacalai Tesque	35406-75	a material for Tris buffer, sample buffer and A68 solution
Trypan Blue Dye 0.40%	Bio-Rad	1450021	cell counting
Ultra-Clear Open-Top Tube, 16 x 96mm	Beckman Coulter	361706	collecting for the P1 EV fraction
Ultra-Clear Tube, 14 x 89mm	Beckman Coulter	344059	collecting for the P2 EV fraction
Vectastain ABC Standard Kit	Vector Laboratories	PK-4000	immunoblotting
Wash Bottle	As One	1-4640-02	washing membrane
μ-Slide 8 Well High	ibidi	80806