Imagem tridimensional de tecidos aórticos na aterosclerose

Resumo

Aqui, apresentamos protocolos otimizados de limpeza de tecido para obter imagens da aorta murina em três dimensões (3D). Delineamos procedimentos de última geração para imunocoloração, limpeza óptica e imagem com a intenção de definir a proximidade anatômica do sistema nervoso periférico com placas ateroscleróticas e a adventícia na aterosclerose.

Resumo

Pesquisas recentes avançaram na compreensão da aterosclerose como uma doença inflamatória crônica transmural envolvendo todas as três camadas da parede arterial, incluindo a placa íntima, a média e a adventícia, que forma o revestimento externo do tecido conjuntivo das artérias. Nossos estudos recentes têm sugerido que a adventícia é utilizada pelo sistema nervoso periférico como um canal para atingir todas as células teciduais. Verificamos também que o sistema nervoso periférico, ou seja, o sistema nervoso sensorial e simpático, sofre grandes processos de remodelação envolvendo a neogênese de redes axônicas adjacentes às placas ateroscleróticas. Nesse contexto, a compreensão da estrutura da rede neural e suas interações com os componentes vasculares das artérias doentes traz grandes promessas para uma melhor compreensão da patogênese das doenças cardiovasculares. Para atingir esses objetivos, são necessários métodos para visualizar a arquitetura subcelular das artérias intactas saudáveis e doentes, juntamente com seus compartimentos perivasculares circundantes. A limpeza do tecido permite imagens intactas de tecidos profundos de compartimentos de tecido maiores que, de outra forma, seriam inacessíveis. Ele permite imagens volumétricas de artérias intactas por meio da integração de ferramentas de rotulagem, limpeza, imagens microscópicas avançadas e processamento de imagens. Aqui, descrevemos duas abordagens distintas, mas complementares, de limpeza passiva de tecidos, ou seja, limpeza de 2, 2-tioodietanol (TDE) de base aquosa e imagem tridimensional habilitada para imunomarcação à base de solvente de limpeza de órgão limpo por solvente (iDISCO) para obter imagens de segmentos aórticos isolados ou aorta inteira in situ em todo o camundongo.

Introdução

As técnicas histológicas fornecem uma compreensão básica das amostras biológicas por meio da secção de tecidos/órgãos. No entanto, o delineamento de interações anatômicas complexas célula/célula e tecido/tecido em três dimansion (3D) tem sido - até recentemente - difícil de alcançar. Essa necessidade não atendida foi particularmente evidente no contexto do sistema cardiovascular em condições saudáveis e doentes. A imagem de tecidos intactos foi um desafio no passado devido à absorção e dispersão de luz, tornando-os intrinsecamente opacos. A limpeza do tecido torna a amostra biológica intacta transparente, minimizando essas limitações. Desenvolvimentos recentes nas técnicas de limpeza de tecidos permitem imagens 3D de alta resolução de tecidos transparentes não seccionados para fornecer informações consideráveis sobre a microarquitetura celular e estrutural de órgãos inteiros com resolução micrométrica, permitindo assim a definição de redes de conectividade anatômica.

A aterosclerose envolve três camadas da parede arterial, incluindo a camada íntima interna, a camada média média e a camada externa de tecido conjuntivo, que é denominada adventícia. As placas ateroscleróticas na camada interna das artérias têm sido um alvo convencional de pesquisa há décadas ^1,2. No entanto, a camada de adventícia contém vasos sanguíneos, vasos linfáticos e fibras nervosas do sistema nervoso periférico. Além disso, a adventícia está ligada ao tecido adiposo perivascular e aos componentes do tecido neuronal, incluindo nervos periféricos e gânglios perivasculares ^3,4. Sabe-se que os nervos periféricos usam a adventícia como condutos para alcançar tecidos-alvo distantes e, de fato,^células5. Nossos estudos recentes avançaram no progresso na compreensão das interações em várias camadas dos principais sistemas biológicos, que incluem o sistema imunológico, o sistema nervoso e o sistema cardiovascular. Denominamos essas interações de interfaces neuroimunes-cardiovasculares ^6,7. Durante a aterogênese, os componentes da parede arterial passam por uma reestruturação e remodelação robustas. Por exemplo, adjacente à progressão da placa aterosclerótica na íntima, formam-se agregados de células imunes e a neogênese do axônio neuronal ocorre na adventícia aórtica murina ^6,8,9. À medida que a aterosclerose progride, os agregados de células imunes se desenvolvem em órgãos linfóides terciários (ATLOs) de artérias bem estruturados com áreas distintas de células T, células B e plasmócitos¹⁰. No entanto, para delinear essas mudanças em 3D, a imagem de alta resolução do tecido intacto tem sido um desafio devido à permeabilização insuficiente da membrana e ao espalhamento de luz inerente¹¹. As abordagens de limpeza de tecidos superaram as principais limitações das abordagens histológicas convencionais 11,12,13,14,15 com maior penetração de anticorpos para atingir profundamente tecidos ou órgãos intactos, ajustando uniformemente o índice de refração (IR), levando a imagens de resolução em escala micrométrica com maior profundidade de imagem em voxels. Os RIs das amostras podem ser combinados com glicerol (RI 1.46) ou óleo de imersão (RI 1.52), reduzindo bastante a dispersão de luz e as aberrações esféricas, permitindo alta resolução. Avanços recentes nas técnicas de limpeza de todo o órgão ou tecido de corpo inteiro, como 2,2-tioodietanol (TDE) à base de água e imagem 3D habilitada para imunomarcação de órgãos limpos com solvente (iDISCO), respectivamente, juntamente com técnicas de imagem volumétrica (incluindo imagens de microscopia confocal, multifotônica e de folha de luz) permitiram reconstruções da microanatomia da arquitetura vascular construindo seu atlas de conectividade^11,16. A visualização dessas conexões celulares e estruturais em 3D pode fornecer novos insights para responder a perguntas biológicas até então não respondidas.

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Protocolo

O presente estudo foi realizado de acordo com as diretrizes do comitê local e nacional de uso e cuidados com animais. Camundongos Apoe^-/- machos hiperlipidêmicos com fundo C57BL/6J mantidos em uma dieta padrão de ração para roedores que desenvolvem espontaneamente aterosclerose durante o envelhecimento foram usados no presente estudo.

1. Imagem de montagem total da aorta isolada e limpeza de TDE

1. Preparação de tecidos
   1. Prepare o anestésico a 150 mg / kg de cetamina e 30 mg / kg de xilazina (ver Tabela de Materiais) por camundongo. Anestesie profundamente os camundongos por injeção intraperitoneal e confirme isso pela falta de reação ao teste de dor profunda.
      NOTA: A concentração e o volume da injeção são os seguintes: Cetamina 100 mg/mL; xilazina 20 mg/mL; Volume de injeção 50:50 mistura por volume de cetamina e xilazina a 3 μL / g.
   2. Coloque o mouse em uma placa de espuma coberta com toalhas de papel cirúrgico e fixe os braços e as pernas em decúbito dorsal com fitas. Desinfete o tórax com etanol a 75% (ver Tabela de Materiais) e retire sangue pelo ventrículo esquerdo com uma seringa descartável de 1 mL para remover o sangue para melhor perfusão.
      NOTA: A coleta de sangue cardíaco por toracotomia também pode ser usada.
   3. Faça uma incisão na linha média do tórax para expor o coração e uma pequena incisão no átrio direito para permitir a perfusão transcardíaca. Perfunda o camundongo através do ventrículo esquerdo com 10 mL de ácido etilenodiaminotetracético 5 mM (EDTA; ver Tabela de Materiais) em solução salina tamponada com fosfato (PBS) por 5 min, seguido por 20 mL de PBS por 5-10 min até que o sangue seja eliminado. Por fim, perfunda com 10 mL de paraformaldeído (PFA) a 4% por 20 min.
      NOTA: Todos os procedimentos podem ser realizados com uma bomba de perfusão peristáltica com pressão de 100-125 mm Hg à temperatura ambiente (RT). A agulha de perfusão é inserida no coração do camundongo através do mesmo orifício da extração de sangue.
   4. Remova órgãos internos, incluindo baço, fígado, pulmão e órgãos gastrointestinais e reprodutivos, usando instrumentos cirúrgicos. Mantenha o coração, a aorta e os rins intactos in situ.
      NOTA: Os instrumentos cirúrgicos usados para dissecção e remoção de órgãos são tesouras de dissecação, tesouras de íris finas, tesouras de mola, pinças rombas, pinças curvas e pinças finas curvas.
   5. Exponha toda a aorta da aorta ascendente à bifurcação ilíaca sob o estereomicroscópio de dissecação (aumento de 30-40x). Remova cuidadosamente o timo e o tecido adiposo sem lesão da aorta.
      NOTA: Tenha cuidado para não cortar a aorta. Para camundongos Apoe^-/- , mantenha o mínimo de tecido adiposo perivascular circundado da aorta para a estrutura conectada.
   6. Colha toda a aorta em uma placa de Petri cheia de PBS. Separe a aorta em diferentes segmentos e divida toda a aorta longitudinalmente usando uma íris ou tesoura de mola para expor a superfície intimal seguindo a sequência e a direção indicadas na Figura 1A para clareamento do TDE.
   7. Prenda a aorta na face frontal na placa de cera preta plana em forma de Y, conforme indicado na Figura 1A. Fixe-o em 4% de PFA durante a noite a 4 °C.
      NOTA: Prenda a aorta na placa de cera antes da fixação para evitar dobrar e enrolar nas etapas a seguir.
   8. Solte a aorta e transfira-a para PBS. Lave bem a aorta por 5 min por 5 vezes.
      NOTA: Transfira a aorta para diferentes tubos cheios de PBS a cada vez para lavar.
2. Coloração de anticorpos para aorta facial
   NOTA: Todas as etapas de incubação são realizadas em tubos de trava segura de 2 mL com rotação suave ou agitação em RT.
   1. Transfira a aorta fixa para uma solução de bloqueio por 2 h para bloqueio e permeabilização.
      NOTA: A solução de bloqueio varia de acordo com os anticorpos primários e secundários. Por exemplo, solução de bloqueio: 0,5 mg / mL CD16 / 32 (1: 100), 10% de soro de burro normal, 2% de Triton X-100 em PBS (ver Tabela de Materiais)
   2. Incube a aorta com anticorpos primários na solução de bloqueio acima (etapa 1.2.1), por exemplo, CD3e (diluição 1:100), NF200 (diluição 1:200) e B220 (diluição 1:200) por 24 h (ver Tabela de Materiais). Lave a aorta em PBS por 5 min por 5 vezes.
   3. Incubar a aorta com anticorpos secundários em soro de burro normal a 10% (diluição 1:300) e 4',6-diamidino-2-fenilindol (DAPI; 1 mg/mL) para coloração nuclear durante a noite (ver Tabela de Materiais). Lave a aorta em PBS por 5 min 5 vezes e armazene a aorta em PBS a 4 ° C até o procedimento de limpeza do tecido.
      NOTA: Transfira a aorta para diferentes tubos cheios de PBS a cada vez para lavar. Cubra os tubos com papel alumínio para mantê-los no escuro para a etapa 1.2.3.
3. Limpeza de tecido TDE
   NOTA: Todas as etapas de incubação são realizadas em tubos de trava segura de 2 mL, girando suavemente em RT e cobertos com papel alumínio no escuro. As soluções de trabalho TDE (ver Tabela de Materiais) são altamente permeáveis e devem ser manuseadas com cuidado em uma capela de exaustão. Colete e descarte os resíduos de acordo com os regulamentos locais.
   1. Transfira a aorta corada para soluções de trabalho TDE a 20% e incube por 1 h.
   2. Transferir a aorta para soluções de trabalho TDE a 47% e incubar durante 12 h. Transfira a aorta para soluções de trabalho TDE a 60% e incube por 24-36 h até que as amostras se tornem transparentes na luz visível para corresponder ao IR.
   3. Armazene a aorta em TDE 60% em RT no escuro até a imagem.
      NOTA: Atualize as soluções de trabalho a cada 30 minutos para o curto prazo de incubação (por exemplo, etapa 1.3.1) e a cada 4 h para longo prazo de incubação (por exemplo, etapa 1.3.2). O tempo de incubação para cada etapa pode ser ajustado dependendo do tamanho do tecido para obter uma melhor penetração de anticorpos ou transparência de limpeza. Para a aorta de camundongo Apoe^-/- cercada por tecido adiposo, o tempo de incubação deve ser estendido adequadamente.
4. Imagem da aorta de limpeza do TDE usando microscópio confocal de varredura a laser (CLSM)
   1. Use poços espaçadores de imagem retangulares pegajosos de dupla face disponíveis comercialmente com uma espessura de 0,2 mm (consulte a Tabela de Materiais). Cole o poço em uma lâmina de vidro limpa e transfira a aorta limpa. Certifique-se de que a adventícia aórtica da face esteja voltada para a lamínula.
      NOTA: Bata suavemente na aorta da face com o lado abluminal da aorta na parte superior usando uma pinça angular. Empilhe vários poços espaçadores de imagem para corresponder ao tamanho do tecido, se necessário.
   2. Monte a aorta com gotas de solução TDE a 60%. Prenda cuidadosamente uma lamínula ao poço, evitando bolhas de ar entre a amostra e a lamínula.
      NOTA: Remova cuidadosamente as bolhas com uma agulha antes da lamínula. Não use uma quantidade excessiva de solução de montagem, pois o sample pode flutuar.
   3. Use um instrumento CLSM invertido (consulte a Tabela de Materiais) equipado com uma objetiva de imersão (multi) 20x (NA: 0.75).
      NOTA: O CLSM permite imagens volumétricas de até 70 μm de profundidade com uma resolução mais alta, o que é necessário para a análise do diâmetro do nervo e da interação nervo-célula imune na adventícia aórtica.
   4. Selecione a objetiva de imersão (óleo) de 20x/0,75. Ajuste os detectores de diodo híbrido com base nos corantes corados. Ajuste as configurações de exibição e selecione o formato XY de 1024 x 1024 pixels para geração de imagens.
      NOTA: Uma lente objetiva de imersão em óleo captura sinais melhor do que a água.
   5. Coloque o óleo de imersão (com glicerol) uniformemente ao longo da aorta na lamínula. Mova a objetiva de 63x grosseiramente em direção à amostra até que ela toque o óleo de imersão/lamínula.
   6. Mova a objetiva 63x finamente sob o microscópio para localizar a região de interesse. Adquira a pilha Z do lado adventício da aorta face em tamanho de passo de 2-4 μm até 60 μm de profundidade para imagens 3D.
   7. Nomeie o arquivo com detalhes da amostra, detalhes da verificação e salve os dados.
5. Imagem da aorta de limpeza de TDE usando um microscópio multifotônico
   1. Siga os passos 1.4.1-1.4.2 para montar a aorta en face no slide.
   2. Use um microscópio multifotônico vertical (consulte a Tabela de Materiais) equipado com uma objetiva de 20x (imersão em água, NA: 1,00, distância de trabalho = 2 mm), permitindo imagens volumétricas de até 1,5 mm de profundidade.
   3. Adquira pilhas Z do lado abluminal em tamanho de passo de 10-15 μm até 700 μm de profundidade. Nomeie o arquivo e salve os dados como na etapa 1.4.7.

2. Imunocoloração de corpo inteiro e limpeza de tecidos iDISCO

1. Preparação de tecidos
   1. Siga as etapas 1.1.1-1.1.3 acima para anestesia, fixação do mouse e perfusão.
   2. Remova a pele e os órgãos internos, incluindo baço, fígado, pulmão e órgãos gastrointestinais e reprodutivos, usando instrumentos cirúrgicos. Mantenha o coração, a aorta e os rins intactos in situ.
   3. Dissecar a parte do corpo acima do nível do diafragma e fixar a parte inferior do corpo com PFA a 4% durante 1-2 dias (s) a 4 °C.
      NOTA: Realize a fixação, lavagens e incubações em tubos de 50 mL em um agitador giratório suave. Atualize a solução em novos tubos por 2-3 vezes.
   4. Lave bem a amostra por 10 min 3 vezes em RT.
      NOTA: Transfira a aorta para diferentes tubos cheios de PBS a cada vez.
   5. Incube a amostra em coquetéis de imagem cérebro/corpo 20% transparentes e desobstruídos e solução de análise computacional (CUBIC) por 48 h para descoloração.
      NOTA: Para solução CUBIC a 20%, dissolva 25 g de uréia em 15 mL de Triton X-100 e 28 mL de Quadrol e adicione PBS ao volume final de 100 mL. Prepare-o no exaustor, pois os ingredientes são estimulantes (ver Tabela de Materiais).
   6. Lavar bem a amostra durante 1 h cinco vezes em PBS à RT.
2. Coloração de anticorpos
   NOTA: Todas as etapas de incubação são realizadas em tubos de trava segura de 50 mL com rotação suave ou agitação a 4 °C.
   1. Incube a amostra em solução de PBS-gelatina-Triton X-100-serum (PGST) durante a noite para permeabilização e bloqueio.
      NOTA: A solução de bloqueio varia de acordo com os anticorpos. Por exemplo, solução de bloqueio: PBS-gelatina-Triton X-100-soro (PGST, consulte a Tabela de Materiais) solução: 0,2% de gelatina de pele suína, 0,5% de Triton X-100 e 5% de soro de cabra em PBS.
   2. Incubar a amostra com anticorpos primários em solução de PGST, por exemplo, NF200 (diluição 1:200, ver Tabela de Materiais) a 4 °C e agitar suavemente durante 10-12 dias. Em seguida, lavar bem a amostra em PGST durante 1 h 5 vezes à RT.
   3. Incubar a amostra com solução de anticorpos secundários (diluição 1:300) e DAPI (1 mg/ml) em PGST a 4 °C durante 7 dias.
   4. Lave bem a amostra em PGST por 1 h 5 vezes em RT. Transfira a amostra para PBS e armazene a aorta em PBS a 4 ° C para etapas posteriores.
      NOTA: Cubra os tubos com papel alumínio para mantê-los escuros para as etapas 2.2.3-2.2.4.
3. Limpeza de tecido iDISCO modificada
   NOTA: Durante a limpeza, os tubos devem ser cobertos com papel alumínio para evitar branqueamento/extinção do sinal devido à exposição direta à luz natural/artificial. Todos os reagentes orgânicos usados na limpeza do DISCO são prejudiciais e todas as etapas de limpeza devem ser feitas em uma capela de exaustão. Use jaleco, luvas e máscara ao lidar com os reagentes para evitar a inalação e o contato com a pele e os olhos. Colete e despeje os resíduos de limpeza em recipientes de lixo apropriados no exaustor.
   1. Transfira as amostras coradas da etapa 2.2.4 para uma série de concentrações aumentadas de soluções de trabalho de tetrahidrofurano (THF, consulte a Tabela de Materiais) para desidratação, ou seja, 50%, 70%, 90% e 100% (duas vezes 100%). Incubar durante 12 h por concentração.
      NOTA: Dilua o reagente THF (99%-100%) em água destilada para soluções de trabalho de diferentes concentrações no exaustor. Atualize as soluções de trabalho a cada 6 h.
   2. Transfira a amostra para solução de diclorometano absoluto (DCM, consulte a Tabela de Materiais) por 3 h para remoção de lipídios.
   3. Transfira a amostra para a solução de trabalho de benzil-álcool-benzilbenzoato (BABB) correspondente ao RI (consulte a Tabela de Materiais). Incube por 3-6 h até que o tecido fique translúcido e quase transparente à luz visível.
      NOTA: Para preparar a solução de trabalho BABB, misture 1 parte de álcool benzílico e 2 partes de benzoato de benzila (1:2) em um frasco de vidro. Agite suavemente por 5 min no capô.
4. Imagem do tecido de limpeza iDISCO usando um microscópio de folha de luz
   NOTA: Visualize a amostra limpa assim que uma transparência ideal for alcançada. Um microscópio de folha de luz, como um ultramicroscópio-II (consulte a Tabela de Materiais), é usado para imagens. Encha o reservatório de imagem com a solução de limpeza final, a solução BABB. Tenha cuidado para não derramar BABB no instrumento para evitar danos ao instrumento.
   1. Use uma objetiva de ar 1x para imagens de baixa ampliação cobrindo toda a largura de toda a amostra. Transfira suavemente a amostra da solução de limpeza para um pano de papel e seque-a brevemente.
      NOTA: Use uma pinça romba para evitar apertar a amostra.
   2. Selecione um porta-amostras de tamanho apropriado com base no tamanho da amostra/tecido e prenda a parte traseira da amostra ao porta-amostras com supercola.
      NOTA: Aguarde 1-2 minutos até que a amostra esteja firmemente presa ao suporte de amostra.
   3. Encha o reservatório de imagem do microscópio de folha de luz com solução BABB e coloque suavemente a amostra nele. Ajuste o porta-amostras para garantir que a amostra esteja perpendicular à folha de luz e iluminada corretamente.
   4. Abaixe a objetiva para focar a amostra e ajuste as configurações de exibição enquanto foca para visualizar a amostra corretamente. Selecione a(s) folha(s) de luz adequada(s) no software do microscópio e ajuste sua largura para iluminar uniformemente todo o viewcampo.
      NOTA: Em um sistema de ultramicroscópio com iluminação a laser de ambos os lados, comece alinhando e focalizando o laser em um lado. Depois que ambos os lados estiverem definidos, ative os lasers de ambos os lados para observar uma imagem de varredura mesclada de ambas as iluminações.
   5. Selecione um canal vermelho distante (680 nm) para obter imagens de estruturas neuronais coradas com NF200 e um canal de autofluorescência (488 nm) para obter imagens de aorta e tecidos conjuntivos não corados. Ajuste a potência do laser dependendo da intensidade do sinal fluorescente para obter uma relação sinal-ruído ideal, o tempo de exposição e a largura da(s) folha(s) de luz.
   6. Selecione o modo de varredura x-y-z. Defina a varredura z-stack com um passo z de 2-8 μm e selecione 25%-60% de sobreposição ao longo do eixo y longitudinal das varreduras de ladrilhos (16 bits) cobrindo as superfícies ventral e dorsal das amostras para obter imagens de todo o volume da amostra (até 6-8 mm de profundidade).
   7. Nomeie a varredura com informações detalhadas, incluindo a data da varredura, nome da amostra, o anticorpo usado, objetiva, fator de zoom, etapas z e lasers usados. Salve os dados.
   8. Mude para uma ampliação maior (2x ou 4x) por meio da função de zoom para obter imagens de regiões específicas do corpo de interesse.
   9. Siga as etapas 2.4.4-2.4.7 acima para obter imagens e salve os dados.

3. Processamento e análise de imagem

NOTA: É necessária uma estação de trabalho de processamento de alta potência para o processamento. Garanta o backup dos dados imediatamente após o processamento devido ao alto volume de imagens (5 a 100 GB por imagem).

1. Processamento de imagens CLSM e multifotônicas
   1. Carregue as imagens lado a lado Z-stack de microscópios CLSM e multifótons para a estação de trabalho de processamento de imagem equipada com o software Las X, Imaris (software de análise de imagem) ou Fiji para visualização, segmentação e quantificação 3D e bidimensional (2D).
   2. Para codificar por cores a profundidade do volume de uma célula ou estrutura, use um software de restauração de imagem (consulte Tabela de Materiais) para deconvolir a imagem bruta e gerar uma projeção de intensidade máxima dos dados desconvoluídos usando o código de cores temporal em Las X ou Fiji.
2. Processamento de imagens de folha de luz
   1. Carregue a série de imagens TIFF lado a lado da pilha Z no software Fiji. Costure imagens com o plug-in de costura de Fiji e salve imagens costuradas no formato TIFF.
      NOTA: Se necessário, compacte as imagens unidas no formato LZW para permitir o processamento rápido com software diferente.
   2. Carregue as imagens unidas no software de visualização 3D (consulte Tabela de materiais) para segmentação de imagens. Rastreie manualmente as estruturas neuronais e vasculares no eixo xyz. Para rastreamento manual de pequenas fibras nervosas, selecione manualmente os sinais NF200⁺ pixel por pixel em cada plano z ao longo de todo o caminho da fibra nervosa entre a aorta e os gânglios.
   3. Carregue imagens pré-processadas no software de análise de imagem (consulte a Tabela de Materiais) para geração de vídeo, visualização 2D e 3D das imagens.
   4. Use a autofluorescência para segmentar a aorta e os tecidos conjuntivos, incluindo linfonodos e músculos, no software de análise de imagem. Aplique pseudocores separadas no software de análise de imagem para visualizar segmentos aórticos distintos, como parede aórtica e placa.
   5. Use a função de equalização de histograma adaptativo com limitação de contraste (CLAHE) no software Fiji para aprimorar o contraste local sobre o fundo das imagens processadas.

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Resultados

Para demonstrar a microanatomia da aorta intacta saudável e doente e revelar as conectividades físicas entre o sistema imunológico, o sistema nervoso e o sistema cardiovascular em modelos de aterosclerose em camundongos, usamos duas abordagens complementares de limpeza de tecidos: limpeza TDE da aorta isolada e limpeza iDISCO de todo o camundongo (Figura 1). Após a imunocoloração total, a aorta da face foi limpa com uma série de soluções de...

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Discussão

A aterosclerose pode ser vista como uma doença inflamatória transmural das artérias envolvendo todas as três camadas da parede arterial. Além disso, as artérias são circundadas pelos tecidos adiposos e neuronais perivasculares. Durante a progressão da aterosclerose, cada um desses tecidos sofre alterações celulares e estruturais consideráveis, o que requer métodos para adquirir acesso óptico subcelular aos tecidos intactos que circundam as artérias saudáveis e doentes. Ess...

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Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
2,2’-thiodiethanol (TDE)	Sigma	166782	Clearing reagent
Amira	Thermo Fisher Scientific		3D visualization software; Image processing software used for manual segmentation and tracing in 3D images
Benzyl alcohol	Sigma	W213713	Clearing reagent
Benzyl benzoate	Sigma	B6630	Clearing reagent
CD16/32	eBioscience	14-0161-82	Blocking solution
Confocal laser scanning microscope	Leica Microsystems	TCS- SP8 3X	Imaging device for multidimensional high-resolution imaging of intact biological tissues or sections with high specificity at subcellular resolution.
DAPI	Invitrogen	D3571	Nuclei marker
Dichloromethane (DCM)	Sigma	270997	Clearing reagent
Dissecting pan-black wax	Thermo Scientific	S17432	Aorta dissection and fixation
Dissection stereomicroscope	Leica Microsystems	Stemi 2000	Mouse organ dissection
Ethanol	Sigma	E7023	Defection
Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA)	Roth	8040.1	Perfusion buffer
Fiji	(ImageJ, NIH)		Open source image processing software for 2D and 3D images
Goat anti-Hamster IgG, Cy3	Dianova	127-165-099	Secondary antibody
Goat anti-Rabbit IgG, Alexa Fluor 680	Thermo Fisher Scientific / Invitrogen	A-21109	Secondary antibody
Goat anti-Rat IgG, Cy5	Dianova	712-175-150	Secondary antibody
Hamster Anti-CD3e	BD Bioscience	145-2C11	Pan-T cell marker
Huygens Professional	Scientific Volume Imaging, The Netherlands	Version 19.10	Image restoration software; Image processing software used mainly for deconvolution of 2D and 3D images
Image processing workstation	MIFCOM	MIFCOM X5	Image processing workstation equipped with all image processing software including Leica application suite X, Fiji, and Imaris for post-processing of images acquired by confocal, multiphoton and light sheet microscopes
Imaris	Bitplane	Version 8.4	Image analysis software; Image processing software used for automated segmentation of 3D images
Incubator and rotator	Marshall Scientific	Innova 4230	Incubation and rotation device during tissue clearing
iSpacer	Sunjin Lab	IS4020	Rectangular well as the sample holder
Ketamine	Livisto		Anesthetic
Leica Application Suite X (LAS-X)	Leica Microsystems	Version 3.5	Image processing software for the images acquired with Leica microscope
Light microscope	Leica Microsystems	DM LB	Imaging device for bright filed imaging
Light sheet  microscope	LaVision BioTech	Ultramicroscope II	Imaging technique for fast, high-resolution imaging of large biological specimens or whole mouse with low light exposure by rapidly acquiring images of thin optical sections.
Multiphoton microscopy	Leica Microsystems	TCS-SP5II MP	Imaging modality for multidimensional, high-resolution imaging of intact and viable biological tissues at sub-cellular and molecular level over prolonged periods of time, deep in the sample and with minimal invasion.
Normal goat serum	Sigma	G9023	Blocking solution
Paraformaldehyde (PFA)	Sigma	P-6148	Fixation
Phosphate-buffered saline (PBS)	Sigma	P4417-100TAB	Washing buffer
Porcine skin gelatin	Sigma	G1890	Incubation buffer
Quadrol	Sigma	122262	CUBIC clearing reagent
Rabbit Anti-NF200	Sigma	N4142	Pan-neuronal marker
Rat Anti-B220	BD Bioscience	RA3-6B2	Pan-B cell marker
Sucrose	Sigma	90M003524V	Dehydration
Sytox	Thermo Fisher Scientific	S11380	Nuclei marker
Tetrahydrofuran	Sigma	401757	Clearing reagent
Triton X-100	Roth	3051.1	Penetration
Urea	Sigma	U5128	CUBIC clearing reagent
Xylene	Fisher Chemical	x/0250/17	Anesthetic