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Neste Artigo

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  • Protocolo
  • Resultados
  • Discussão
  • Divulgações
  • Agradecimentos
  • Materiais
  • Referências
  • Reimpressões e Permissões

Resumo

O experimento usado aqui mostra um método de docking molecular combinado com tecnologias de sonda para prever e validar a interação entre pequenas moléculas da medicina tradicional chinesa e alvos proteicos.

Resumo

As enzimas desubiquitinantes (DUBs) desempenham um papel fundamental na modulação da homeostase da ubiquitinação, sendo o UCHL3 um arquétipo de cisteína DUB intrinsecamente envolvido em uma miríade de processos fisiológicos e patológicos. Portanto, o desenvolvimento de inibidores de pequenas moléculas direcionados à ubiquitina C-terminal hidrolase L3 (UCHL3) é de grande importância. Este protocolo tem como objetivo estabelecer um processo de triagem virtual e validação in vitro de inibidores de pequenas moléculas de cisteína DUB representados por UCHL3. Em primeiro lugar, os inibidores potenciais de UCHL3 são virtualmente rastreados usando a tecnologia de docking molecular, e a interação entre drogas e alvos proteicos é visualizada. Posteriormente, a eficácia do medicamento rastreado, Danshensu, é verificada por meio de ensaios de inibição da atividade in vitro . A ubiquitina-7-amino-4-metilcumarina (Ub-AMC) e a hemaglutinina-ubiquitina-vinil sulfona (HA-Ub-VS) são usadas como sondas para testes de atividade in vitro , pois podem se ligar competitivamente ao DUB com inibidores de pequenas moléculas para avaliar a atividade do UCHL3. Os resultados indicam que Danshensu tem uma boa afinidade de ligação com UCHL3 em docking molecular, e pode inibir competitivamente a atividade de UCHL3 com HA-Ub-VS. Esses achados fornecem referências importantes para futuras pesquisas e desenvolvimento de drogas terapêuticas direcionadas ao UCHL3.

Introdução

A ubiquitinação é uma modificação pós-traducional de proteínas, um processo pelo qual as enzimas ativadoras de ubiquitina E1, as enzimas conjugadoras de ubiquitina E2 e as ubiquitina ligases E3 ligam a ubiquitina à proteína alvo, e todo o processo de ubiquitinação pode ser revertido por enzimas desubiquitinantes (DUBs) 1 , 2 , 3 , 4 . Devido ao seu importante papel fisiológico e patológico, os DUBs são considerados alvos importantes para a descoberta de medicamentos 5,6.

Mais de 100 DUBs foram identificados em humanos 7,8. Eles normalmente funcionam como uma isopeptidase responsável por clivar a ligação isopeptídica entre o terminal C da ubiquitina e um resíduo de lisina em um substrato ou outra molécula de ubiquitina 9,10. Atualmente, eles são categorizados principalmente em sete famílias principais, a saber: peptidases específicas de ubiquitina (USPs), proteases de tumor ovariano (OTUs), proteases de domínio N-terminal + + Jab1 / Mov34 / Mpr1 Pad 1 (JAMMs), motivo interagindo com novas proteases da família DUB contendo ubiquitina (MINDYs), hidroxilases C-terminal de ubiquitina (UCHs), proteases de domínio Machado-Josephin (MJDs) e peptidase de ubiquitina 1 contendo dedo de zinco (ZUP1) 9. Além dos JAMMs, que pertencem à família das metaloproteases do zinco11, os outros DUBs são cisteína proteases caracterizadas por uma tríade catalítica composta por cisteína catalítica, histidina e um terceiro resíduo ácido12,13. Essa especificidade abre caminhos para o desenvolvimento de inibidores de moléculas pequenas direcionados ao sítio ativo da enzima ou bolsas alostéricas próximas.

No campo da pesquisa de enzimas desubiquitinantes, existe um desafio significativo na caracterização de sua atividade14,15. A caracterização baseada em sondas ativas serve como uma abordagem crucial para o estudo de inibidores de DUB16. Ao realizar ensaios competitivos com sondas e inibidores baseados em atividade em lisados celulares ou proteínas recombinantes, a atividade dos DUBs pode ser caracterizada, facilitando o desenvolvimento de inibidores de moléculas pequenas direcionados a essas enzimas. Ub-AMC é uma sonda inicial usada para detectar a atividade de DUB, que tem um grupo fluorescente ligado à extremidade C-terminal da ubiquitina17,18. Quando os DUBs exercem sua atividade catalítica, o AMC é liberado em grandes quantidades e a intensidade fluorescente de sua luz detectada é aumentada de acordo. Esta sonda tem sido amplamente utilizada na triagem de alto rendimento de inibidores de DUB19,20. A sonda HA-Ub-VS também é usada para medir a atividade de DUB21. Possui um grupo vinil sulfona no terminal C da ubiquitina, tornando-se um substrato suicida para DUBs. Após a separação por eletroforese em gel de dodecil sulfato de sódio e poliacrilamida (SDS-PAGE), DUBs ativos podem ser detectados usando western blotting 22,23,24.

A medicina tradicional chinesa (MTC) usa plantas medicinais há mais de 2000 anos. O desenvolvimento de novos medicamentos a partir de produtos naturais é de grande importância médica, com foco principal na identificação de princípios ativos e na elucidação de seus mecanismos25. Salvia miltiorrhiza O Bge é uma erva amplamente utilizada no tratamento de uma variedade de doenças, incluindo câncer, cardiovasculares, hepáticas e neurológicas26. Atualmente, contém pequenas moléculas conhecidas, como tanshinone27, Danshensu28, ácido tanshinic29, etc. Esses compostos exibem diversas atividades biológicas, como efeitos antitrombóticos, antioxidantes e antitumorais, tornando-os altamente valiosos para pesquisas26. Estudos recentes identificaram o Danshensu como um inibidor covalente da protease semelhante à 3-quimotripsina (3CLpro) do SARS-CoV-230. Demonstrou-se que forma uma ligação covalente com o resíduo do sítio ativo C145 de 3CLpro, indicando a presença de potenciais inibidores de protease de moléculas pequenas em Salvia miltiorrhiza Bge.

A ubiquitina C-Terminal Hidrolase L3 (UCHL3) pertence às cisteína proteases dentro da família UCH de DUBs. Ele se baseia em resíduos conservados como cisteína 95 , histidina 169 e ácido aspártico 184 para catalisar suas funções de forma eficaz31 , 32 . Ele desempenha papéis cruciais em várias vias moleculares, incluindo o ciclo celular, recombinação homóloga e reparo de quebras de DNA ligadas a proteínas33. Além disso, é regulado positivamente em vários tipos de câncer, como câncer de ovário, próstata, pâncreas, colorretal e pulmão de células não pequenas34. Com base nesses estudos, o UCHL3 parece ser um alvo promissor para o tratamento de doenças. Vários inibidores de moléculas pequenas de UCHL3 foram identificados e estão progredindo para uso clínico35,36.

Neste estudo, o docking molecular foi realizado para investigar interações entre pequenas moléculas de Salvia miltiorrhiza Bge e UCHL3. Posteriormente, um experimento in vitro usando sondas específicas para DUB Ub-AMC e HA-Ub-VS identificou Danshensu como um inibidor de molécula pequena de UCHL3. O docking molecular também previu potenciais locais de ligação para Danshensu, sugerindo seu mecanismo de ação.

Protocolo

1. Baixando as estruturas de pequenas moléculas de Salvia miltiorrhiza Bge e o UCHL3

  1. Baixe o arquivo de molécula pequena.
    1. Abra o banco de dados TCMSP (https://old.tcmsp-e.com), insira danshen (nome da erva), pressione pesquisar e clique em Radix Salviae na lista de resultados.
    2. Clique em baixar um por um dos itens e salve a estrutura 2D no formato .mol2.
  2. Baixe o arquivo de proteína.
    1. Abra o banco de dados PDB (https://www.rcsb.org/), insira UCHL3 e pressione pesquisar. Clique em Homo sapiens e pressione pesquisar em refinamentos.
    2. Selecione a estrutura 1XD3 com cocristalização de molécula-proteína pequena, clique em baixar arquivos e selecione o formato PDB .

2. Acoplamento molecular

  1. Salve o arquivo.
    1. Crie uma nova pasta chamada danshen_UCHL3 docking na área de trabalho e salve os compostos das estruturas Salvia miltiorrhiza Bge e UCHL3 nesta pasta. Nomeie a pasta em inglês; caso contrário, o arquivo não será importado.
  2. Defina o caminho.
    1. Abra o software Maestro, clique em Arquivo, selecione Alterar diretório de trabalho, clique em Área de trabalho, clique duas vezes para selecionar a pasta de encaixe danshen_CUHL3 e clique em Escolher opções.
  3. Processamento de moléculas pequenas
    1. Importe estruturas de moléculas pequenas.
      1. Clique nas opções Arquivo e Importar estruturas. Clique em Área de trabalho, clique duas vezes na pasta de encaixe e clique no arquivo de estrutura Salvia miltiorrhiza Bge. Em seguida, clique em Abrir para importar todas as moléculas pequenas.
    2. Prepare a pequena molécula.
      1. Clique em Tarefas e selecione a opção LigPrep . Na janela LigPrep exibida, clique na tabela do projeto na opção Usar estrutura de , marque a opção Determinar quiralidades da estrutura 3D em computação e deixe todas as outras configurações de software como padrão.
      2. Altere o nome do trabalho para danshen_ligprep1 e clique em Executar para executar o processamento de moléculas pequenas.
  4. Processamento da estrutura da proteína
    1. Importe a estrutura da proteína.
      1. Clique nas opções Arquivo e Importar estruturas , clique em Área de trabalho e clique duas vezes na pasta de encaixe danshen_CUHL3.
      2. Clique no arquivo de estrutura de proteína UCHL3 e, em seguida, clique em Abrir para importar o arquivo de estrutura de proteína.
    2. Prepare a proteína.
      1. Selecione as duas ligações covalentes que conectam UCHL3 e a molécula pequena e exclua-as usando o botão Excluir . Em seguida, selecione os dois resíduos de proteína que estão incompletos após a exclusão. Clique no botão Construir , selecione Outras edições e, em seguida, para Gly75, clique no botão C , para Cys95, escolha Resíduo de Mutação e CYS.
      2. Clique em Tarefas e selecione a opção Fluxo de trabalho de preparação de proteína . Deixe todas as outras configurações de software como padrão. Altere o nome do trabalho para UCHL3_protein pre e clique em Executar para executar o processamento de proteínas.
    3. Configure a caixa de encaixe.
      1. Clique em Tarefas, escolha Geração de grade de receptor e selecione Escolher para identificar a molécula de ligante . Selecione a pequena molécula no espaço de trabalho e uma caixa de encaixe rosa centralizada nas coordenadas da molécula pequena aparecerá.
      2. Mantenha as configurações padrão, nomeie o trabalho como 1XD3_danshen_glide_grid e clique em Executar.
        NOTA: Em 1XD3, a pequena molécula forma uma ligação covalente com a proteína. É necessário remover essa ligação covalente para separar a pequena molécula da proteína. Caso contrário, durante o processo de configuração da grade receptora, a pequena molécula não pode ser selecionada.
  5. Execute o acoplamento molecular.
    1. Clique em Tarefas e selecione a opção Encaixe de ligante . Selecione a Grade do Receptor, clique em Do arquivo e, em seguida, clique em Procurar. Selecione 1XD3_danshen_glide_grid.zip arquivo e clique em Abrir.
    2. Clique em Usar ligantes de como arquivos e, em seguida, clique em Procurar. Clique danshen_ligprep1 arquivo, selecione danshen_ligprep1-out. arquivo maegz e clique em Abrir.
    3. Clique em Configurações e selecione a opção Precisão como controladora de armazenamento , altere o nome do trabalho para danshen_UCHL3_ _SP de encaixe deslizante e clique em Executar.
  6. Exiba os resultados do encaixe.
    1. Clique nas opções Arquivo e Importar estruturas . Clique em Área de trabalho e clique duas vezes na pasta de encaixe danshen_CUHL3.
    2. Clique duas vezes no arquivo danshen_UCHL3_ _SP glidedock , clique no arquivo danshen_UCHL3_ glidedock _SP_pv.maegz e clique em Abrir.
    3. Clique na opção Tabela e exiba a pontuação em pontuação de encaixe.
  7. Visualize as interações danshensu e UCHL3.
    1. Clique duas vezes no arquivo danshen_UCHL3_glidedock _SP_pv.maegz e abra-o no Maestro. Na lista de entradas, segure Shift e selecione simultaneamente danshensu e a proteína.
    2. Clique com o botão direito do mouse e selecione Mesclar para criar uma nova estrutura. Selecione a nova estrutura, clique com o botão direito do mouse, escolha Exportar, clique em Estruturas, nomeie o arquivo danshensu_UCHL3 e exporte-o no formato .pdb.
    3. Selecione a estrutura de mesclagem no painel, clique em Tarefas, selecione Sketcher 2D e obtenha uma imagem de estrutura 2D da interação entre danshensu e UCHL3.
    4. Importe o arquivo danshensu_UCHL3.pdb para o software pymol e visualize com base na estrutura 2D obtida do Maestro.

3. Purificação da proteína UCHL3

  1. Construção do plasmídeo de expressão procariótica pHUE-UCHL3
    1. Obtenha a sequência codificante do gene da proteína recombinante UCHL3 do NCBI (isform2). Integrar o fragmento gênico obtido no vetor pHUE-10HIS via recombinação homóloga e transformá-lo em células competentes para DH5α. Extraia o DNA do plasmídeo para obter a construção desejada.
  2. Indução e purificação de proteínas recombinantes
    1. Cultura bacteriana:
      1. Transforme os plasmídeos recombinantes em células competentes para BL21 (DE3) e espalhe-os em placas de ágar Luria-Bertani (LB) contendo ampicilina. Incubar as placas a 37 °C durante a noite.
      2. Escolha colônias individuais, inocule-as em 12 mL de meio LB líquido suplementado com 50 μg / mL de ampicilina e cultive durante a noite a 37 ° C.
    2. Transformação e indução
      1. Dilua a cultura bacteriana durante a noite para 2% usando um meio fresco. Quando OD600 atingir 0,4-0,6, adicione isopropil-beta-D-tiogalactopiranosídeo (IPTG) a uma concentração final de 0,4 mM para indução de baixa temperatura a 16 ° C por 12 h.
    3. Coleção de cultura bacteriana
      1. Transfira a cultura bacteriana para tubos de centrífuga estéreis e centrifugue a 2200 x g por 10 min. Remover o sobrenadante e conservar as estirpes a -80 °C para conservação.
    4. Sonication
      1. Ressuspenda a cepa em 25 mL (1/20 da cultura bacteriana coletada) de tampão 1 (50 mM HEPES pH 7,5, 200 mM NaCl, 1 mM EDTA). Realize a sonicação bacteriana nas seguintes condições: ligado por 4 s, desligado por 6 s, energia ajustada em 60%, por 15 min. Adicione 1% de Triton X-100 e lise a 4 °C por 30-60 min.
    5. Separação do sobrenadante e do pellet
      1. Centrifugar a amostra a 9000 x g a 4 °C durante 30 min. Recolher o sobrenadante e filtrá-lo através de um filtro de membrana de 0,45 μm. Reserve 50 μL do sobrenadante como entrada.
      2. Ressuspenda o pellet no tampão 1, adicione uma quantidade apropriada de 5x sample tampão (25% 1M Tris-HCl [pH 6,8], 10% de dodecil sulfato de sódio, 0,5% de azul de bromofenol, 41,67% de glicerol e 10% de DL-ditiotreitol) e ferva a 100 °C por 10 min.
  3. Purificação de proteínas
    1. Equilíbrio da coluna
      1. Carregue 1 mL de resina de níquel NiNTA na coluna, deixe-a repousar por 10 min e, em seguida, equilibre sequencialmente a coluna com 5 volumes de coluna de tampão 2 (50 mM HEPES pH 7,5, 50 mM NaCl) contendo 10 mM, 500 mM e 10 mM de imidazol.
      2. Use uma pipeta para adicionar 5 mL (aproximadamente 5 volumes de coluna) da solução de imidazol 10 mM ao longo da parede da coluna. Faça este processo sem controlar a vazão.
      3. Quando o líquido cobrir apenas o material de embalagem e estiver quase drenado, adicione sequencialmente 5 volumes de coluna da solução de imidazol 500 mM e da solução de imidazol 10 mM para equilibrar. Quando a solução de imidazol 10 mM restante cobrir apenas o material de embalagem, feche o controlador de fluxo para interromper o equilíbrio.
    2. Purificação de proteínas
      1. Passe o sobrenadante de proteína filtrado pela coluna a uma taxa de fluxo de 0,5 mL / min (<15 s por gota), coletando a fração de fluxo. Prepare um gradiente de concentração de 10 mM, 30 mM, 50 mM e 100 mM de imidazol usando o tampão 2, juntamente com 0,5 M de NaCl.
      2. Eluir sequencialmente de concentrações baixas a altas de imidazol, usando uma pipeta para adicionar aproximadamente 5 volumes de solução de coluna ao longo da parede da coluna sem controlar a taxa de fluxo. Colete o eluato em tubos de microcentrífuga limpos de 1,5 mL, tomando 1 mL de fluxo por tubo.
      3. Depois de coletar cinco tubos, pegue 1 μL de fluxo de cada tubo para reagir com 1 μL de tampão Bradford. Se a reação permanecer azul, continue as etapas; se ficar transparente, pare a eluição nessa concentração e mude para a próxima.
      4. Após eluição com 100 mM de imidazol, lave com 10 volumes de coluna de NaCl 0,5 M sem controlar a vazão ou coletar o eluato.
      5. Finalmente, eluir com 500 mM de imidazol (<15 s por gota). Usando uma pipeta, adicione 1 mL da solução à coluna, mantendo a taxa de eluição lenta acima mencionada. Colete 1 mL do eluato usando um tubo de microcentrífuga de 1,5 mL e repita esse processo 10 vezes.
    3. Avalie a proteína purificada usando a coloração Coomassie Brilliant Blue.
      1. Quantifique o pellet obtido anteriormente, o sobrenadante de pré-purificação e os 10 tubos de proteína coletados retirando 10 μL de cada grupo e adicionando o tampão de amostra 5x apropriado e, em seguida, aquecendo a 100 ° C por 5 min.
      2. Preparar a solução-padrão de albumina de soro bovino (BSA) a 1 mg/ml, 500 μg/ml e 100 μg/ml. Em seguida, adicione o tampão de amostra 5x apropriado e aqueça a 100 °C por 5 min.
      3. Realize a eletroforese em gel SDS-PAGE nas amostras, remova o gel e incube-o à temperatura ambiente (RT) na solução Coomassie Brilliant Blue em um agitador de baixa velocidade durante a noite.
      4. No dia seguinte, transfira o gel para uma solução descolorante (40% etanol, 10% ácido acético, 50% H2O) para descoloração, aplicando fogo suave conforme necessário. Assim que o gel estiver transparente, observe em um instrumento de desenvolvimento para quantificar a proteína purificada com base nos níveis de BSA e avaliar a pureza verificando se há uma única banda.
    4. Armazenamento de proteínas: Alicotar a proteína em tubos de microcentrífuga a 50 μL por tubo, congelar rapidamente em nitrogênio líquido e armazenar a -80 °C.

4. Ensaio de atividade UCHL3 (ensaio Ub-AMC)

  1. Preparação de proteínas
    1. Descongelar a proteína no gelo, centrifugar a amostra a 1000 x g em RT durante 3 min e determinar a concentração de proteína utilizando o método BCA. Diluir a proteína até uma concentração de 40 nM utilizando o tampão 1.
  2. Configurando grupos
    1. Designe o Buffer 1 como o grupo de controle e o UCHL3 como o grupo experimental. Adicione 200 μL de cada amostra por poço em uma placa de 96 poços, configurando 3 réplicas por grupo.
  3. Detecção
    1. Pouco antes da medição, adicione rapidamente Ub-AMC a cada poço e agite vigorosamente por 2-5 s. A concentração de Ub-AMC utilizada é de 250 nM. Meça os valores de diâmetro externo no comprimento de onda de excitação de 380 nm e no comprimento de onda de emissão de 460 nm em condições de 37 °C, fazendo leituras a cada 30 s por até 10 min.

5. Ensaio de inibição da atividade de UCHL3 por HA-Ub-VS (ensaio HA-Ub-VS)

  1. Preparação de proteínas
    1. Descongelar a proteína no gelo, centrifugar a amostra a 1000 x g em RT durante 3 min e determinar a concentração de proteína utilizando o método BCA. Diluir a proteína até uma concentração de 10 μg/ml.
  2. Preparação de pequenas moléculas
    1. Pese Danshensu e dilua-o em um gradiente usando água de alta pureza para 5 mM, 1 mM, 100 μM, 10 μM e 1 μM.
  3. Configurando grupos
    1. Configure o grupo de proteína pura e o grupo sem drogas de moléculas pequenas como grupos de controle negativo. Use PR619 (inibidor de DUB) como grupo de controle positivo e os outros grupos como grupos de tratamento com medicamentos de moléculas pequenas.
  4. Preparação da amostra
    1. De acordo com o agrupamento, adicione sequencialmente 9 μL de UCHL3 e 1 μL de Dansensu nas concentrações correspondentes a cada grupo tratado com o medicamento. Adicionar 1 μL de PR619 (50 μM em utilização) ao grupo de controlo positivo. Use água de alta pureza e tampão 1 para compensar o grupo de controle negativo.
    2. Misturar bem por vórtice e incubar a 37 °C durante 30 min. Colocar as amostras de reacção no gelo, adicionar HA-Ub-VS a uma concentração final de 1 μM, misturar bem por vórtice e incubar a 37 °C durante 30 min.
    3. Adicione uma quantidade apropriada de 5x tampão de amostra e aqueça em um banho de metal a 100 ° C por 10 min. Coloque as amostras em RT por 5 min e carregue no gel.

6. Mancha ocidental

  1. Preparação do gel SDS-PAGE
    1. Enxágue um conjunto de painéis de vidro com água ultrapura. Coloque as placas no clampslot e, em seguida, em uma placa transparente. Adicione água ultrapura e verifique o vazamento por 10 min.
    2. Prepare a cola de separação de acordo com a mesa de distribuição de cola.
    3. Despeje a água de alta pureza do de gel e absorva a água restante com papel de filtro. Adicione rápida e uniformemente o gel separador de 12% preparado. Em seguida, adicione 1 mL de isopropanol e aguarde aproximadamente 30 min até que o gel solidifique.
    4. Prepare a camada superior de cola concentrada de acordo com a mesa de distribuição de cola.
    5. Remova o isopropanol da parte superior do gel de separação, lave-o 3 vezes com água de alta pureza e seque com papel de filtro. Adicione rapidamente o gel de empilhamento a 3% preparado, insira um pente de 1,0 mm e 15 orifícios e aguarde aproximadamente 30 min.
      NOTA: Mantenha o pente perpendicular à superfície da cola e certifique-se de que não apareçam bolhas de ar.
  2. Eletroforese
    1. Remova verticalmente o pente e despeje uma quantidade suficiente de tampão de corrida na câmara interna do aparelho de eletroforese, garantindo que o líquido cubra os poços de amostra.
    2. Colocar o marcador de proteínas e as amostras experimentais preparadas em RT, vórtice completamente e centrifugar brevemente. Adicione 3 μL de marcador de proteína no primeiro poço de amostra à esquerda, seguido por 10 μL de amostra experimental em cada poço subsequente.
    3. Adicione uma quantidade adequada de tampão de corrida na câmara externa do tanque de eletroforese, cubra o tanque com sua tampa e conecte a fonte de alimentação. Certifique-se de que a fonte de alimentação esteja conectada corretamente.
    4. Ligue a fonte de alimentação e ajuste a tensão para 80 V até que as amostras se concentrem em linhas, depois aumente a tensão para 120 V assim que a separação começar no gel de separação.
      NOTA: Durante o processo, certifique-se de que não se formem bolhas na parte inferior. Se aparecerem bolhas, incline o aparelho de eletroforese para um lado para expulsá-las.
  3. Transferir para a membrana
    1. Use uma faca de plástico para abrir o de gel. Corte um canto no canto superior esquerdo onde o carregamento da amostra começou a marcar a orientação. Mergulhe o gel e o papel de filtro necessário no tampão de transferência por 1-2 min.
    2. Meça e corte a membrana de difluoreto de polivinilideno (PVDF) de acordo com o tamanho necessário para a proteína alvo. Ative a membrana de PVDF mergulhando-a em metanol por 20 s a 1 min e, em seguida, mergulhe-a com o gel no tampão de transferência.
    3. Despeje uma pequena quantidade de tampão de transferência no aparelho de transferência e use um rolo para molhar a unidade de transferência semi-seca. Organize os componentes na seguinte ordem de baixo para cima: três camadas de papel de filtro, gel, membrana de PVDF e mais três camadas de papel de filtro.
    4. Depois de colocar cada camada, use o rolo para remover quaisquer bolhas. Molhe a tampa com tampão de transferência e cubra o aparelho.
      NOTA: Certifique-se de que uma quantidade adequada de buffer de transferência esteja presente, adicionando uma pequena quantidade após completar cada camada. Prepare as marcações com antecedência, distinguindo entre os lados esquerdo e direito do gel onde as amostras foram carregadas, bem como identificando a frente e a parte de trás da membrana. Depois que cada camada for colocada, role suavemente para remover as bolhas.
    5. Ligue a fonte de alimentação, garantindo a polaridade correta. Ajuste a corrente para 190 mA e defina o tempo para 45 min.
  4. Bloqueio
    1. Prepare uma solução de leite em pó desnatado a 5% em TBST (1% Tween20) como tampão de bloqueio. Coloque a membrana de PVDF com a frente voltada para cima em uma caixa de hibridização, despeje 10 mL de tampão de bloqueio e agite suavemente em um agitador de baixa velocidade em RT por 1 h para bloquear.
  5. Incubação de anticorpo primário
    1. Prepare o anticorpo primário com solução de anticorpo1 a 1:1000 e adicione 10 mL de anticorpo primário à nova caixa de incubação. Coloque a caixa de incubação em uma câmara fria a 4 °C e mantenha-a em um shaker durante a noite.
  6. Incubação de anticorpos secundários
    1. Colete o anticorpo primário na caixa de incubação no dia seguinte, adicione a solução adequada de TBST e coloque-a em uma coqueteleira para lavar por 5 min, repita 3 vezes.
    2. Prepare o anticorpo secundário com solução de leite a 5% a 1:5000. Coloque 1 mL de anticorpo secundário no fundo de uma caixa de hibridização umedecida. Coloque a membrana de PVDF com o lado da proteína voltado para baixo no anticorpo secundário e, em seguida, incube em RT em um agitador de baixa velocidade por 1,5 h.
    3. Adicione a solução adequada de TBST e coloque-a em uma coqueteleira para lavar por 5 min; Repita 3 vezes.
  7. Expondo as tiras
    1. Pegue volumes iguais de reagentes quimioluminescentes A e B, agite e misture bem. Proteja a solução da luz.
    2. Aplique a solução de revelação uniformemente na membrana de PVDF, agitando-a suavemente para garantir que a membrana seja uniformemente revestida com a solução.
    3. Coloque a membrana no sistema de imagem de gel e defina o tempo de exposição, o número de exposições e outros parâmetros relevantes.
      NOTA: O desenvolvedor deve cobrir completamente a faixa e o desenvolvimento deve estar em um ambiente escuro.

Resultados

Para filtrar as pequenas moléculas na Salvia miltiorrhiza Bge que podem efetivamente inibir o UCHL3, realizamos o acoplamento molecular entre as pequenas moléculas obtidas no site do TCMSP com o UCHL3. As 30 principais moléculas pequenas nos resultados de encaixe e suas pontuações são mostradas na Tabela 1. Os resultados do acoplamento para todas as moléculas pequenas são apresentados na Tabela Suplementar 1. Selecionamos Danshensu como ...

Discussão

Os DUBs desempenham um papel crucial na regulação da homeostase de todo o sistema de ubiquitina, removendo a ubiquitina de substratos ou cadeias de poliubiquitina37. Nos últimos anos, essas enzimas também têm atraído muita atenção como alvos para o desenvolvimento de fármacos13. No entanto, existem desafios no processo de desenvolvimento de medicamentos de moléculas pequenas. Por exemplo, a triagem de alto rendimento envolvendo de...

Divulgações

Os autores declaram não haver conflitos de interesse.

Agradecimentos

Este trabalho foi apoiado pela Fundação Nacional de Ciências Naturais de Pequim [número de concessão 7244498].

Materiais

NameCompanyCatalog NumberComments
30% AcrylamideBeijing Lablead Biotech Co., LtdA3291
Ammonium persulfateChina National Medicines Corporation Ltd10002616
Anti-rabbit IgG, HRP-linked Antibody #7074Cell Signaling Technology7074P2
BeyoECL PlusBeyotimeP0018S
Bradford Protein Assay KitBeyotimeP0006
ClonExpress Ultra One Step Cloning KitVazymeC115-01
DanshensuShanghai yuanye Bio-Technology Co., LtdB20254
DMSOAmeresco, Inc.21K2356571
Electrophoresis SystemLiuyi Biotechnology112-0630
HEPESSigmaH3375
His-tagged protein purification kit (NTA-Ni agarose magnetic beads)BeyotimeP2247S
Immun-Blot PVDF Membrane, Roll, 26 cm x 3.3 mBio-Rad Laboratories (Shanghai) Co., Ltd1620177
Isopropyl alcoholMacklinI811925
M5 Prestained Protein LadderMei5 Biotechnology Co.LtdMF-212-01
MaestroSchrödinger’shttps://www.schrodinger.com/platform/products/maestro/
Methyl alcoholChina National Medicines Corporation Ltd10014108
MF-MilliporeMilliporeHAWP04700
MyFug mini centrifugeSigmaZ764183
Pierce Dilution-Free Rapid Gold BCA Protein AssayThermo ScientificA55860
PR-619Cell Signaling Technology26065S
Primary Antibody Dilution Buffer for Western BlotMacklinP917820
Recombinant Human HA-Ubiquitin Vinyl Sulfone Protein, CFR&D SystemsU-212-025
Recombinant Human Ubiquitin AMC Protein, CFR&D SystemsU-550-050
Skim MilkBecton,Dickinson and Company232100
Sodium Dodecyl Sulfate (SDS)Ameresco, Inc.205-788-1
TEMEDAmeresco, Inc.2545C134
Tween 20Beijing Lablead Biotech Co., Ltd0777-1
UCHL3 (D25E6) Rabbit mAbCell Signaling Technology8141T

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