Desenvolvimento de um sistema de protoplastos de repolho para estudo da tolerância à hipóxia em brássicas

Resumo

Este protocolo descreve um sistema eficiente de protoplastos de mesofilo de repolho. Vários tratamentos deficientes em oxigênio foram testados, e o sistema mostrou uma alta ativação de genes responsivos à hipóxia, facilitando estudos dos mecanismos genéticos e moleculares de tolerância ao alagamento em vegetais de Brassicaceae .

Resumo

À medida que as mudanças climáticas trazem chuvas mais fortes, o repolho, um vegetal chave de Brassicaceae , enfrenta perdas significativas de rendimento devido ao estresse de hipóxia induzido por inundações. Para identificar mecanismos de tolerância a inundações em repolhos, é necessária uma plataforma versátil para estudos genéticos funcionais para superar a natureza recalcitrante de transformação dos repolhos. Neste estudo, foram desenvolvidos um sistema de expressão transitória de protoplastos de repolho e um protocolo de indução de hipóxia de protoplastos correspondente. Este protocolo alcançou um alto rendimento e integridade do isolamento de protoplastos de folhas de couve, com uma eficiência de transfecção superior a 40% usando condições enzimáticas otimizadas. Para aliviar a potencial influência hipóxica antes dos tratamentos, a solução W5 foi borbulhada com gás oxigênio para aumentar os níveis de oxigênio dissolvido. Vários produtos químicos para ajustar os níveis de oxigênio e tratamentos fisiológicos de eliminação de oxigênio foram testados, incluindo EC-Oxyrase, OxyFluor, sulfito de sódio e um pacote de absorvedor de oxigênio. Ensaios de dupla luciferase mostraram que os promotores dos genes de resposta respiratória anaeróbia BoADH1 e BoSUS1L foram ativados em protoplastos de repolho após tratamentos de hipóxia, com o maior nível de indução observado após o tratamento com o pacote absorvedor de oxigênio. Em resumo, o sistema de expressão transitória do protoplasto do repolho combinado com o tratamento da hipóxia demonstra uma plataforma eficiente e conveniente. Esta plataforma pode facilitar estudos da função gênica e mecanismos moleculares associados às respostas à hipóxia em repolhos.

Introdução

A mudança climática global exacerbou as inundações, que surgiram como uma questão cada vez mais crítica em todo o mundo. Nas últimas décadas, houve uma tendência de aumento na frequência de eventos de inundação, resultando em perdas substanciais de safra ^1,2. O repolho (Brassica oleracea var. capitata L.), uma hortaliça de significativa importância mundial, é suscetível aos efeitos adversos de chuvas intensas, necessitando do desenvolvimento de cultivares de repolho tolerantes a inundações para garantir uma produção sustentável diante de eventos climáticos extremos. Portanto, entender os mecanismos moleculares associados ao estresse de inundação em repolho é essencial para enfrentar esse desafio.

Para entender os mecanismos de regulação gênica em plantas sob condições submersas, linhagens transgênicas são amplamente utilizadas para estudos genéticos funcionais. No entanto, essa abordagem é limitada por altos custos, processos de transformação e subcultura demorados, bem como baixas eficiências de transformação em muitas espécies de culturas, necessitando do desenvolvimento de metodologias alternativas. Sistemas de expressão transiente baseados em protoplastos têm sido amplamente aplicados na pesquisa molecular de plantas como uma alternativa versátil e eficiente. Esses sistemas facilitam as investigações sobre a atividade do promotor, vias de sinalização em resposta a pistas ambientais, interações proteína-proteína ou proteína-DNA e localização subcelular³. O estabelecimento de sistemas de expressão transitória de protoplastos tem sido relatado não apenas em plantas modelo ^4,5, mas também em culturas economicamente importantes, como cana-de-açúcar⁶, cravo⁷, orquídeas Phalaenopsis ⁸ e berinjela⁹. Além disso, esses sistemas foram implementados com sucesso em plantas lenhosas, incluindo Camellia oleifera¹⁰e Populus trichocarpa¹¹. No entanto, os protocolos de aplicação de sistemas de protoplastos para estudar vegetais folhosos sob estresse de hipóxia induzida por submersão são limitados. Portanto, um protocolo integrado foi desenvolvido neste trabalho para os interessados em estudar as respostas à hipóxia em vegetais folhosos usando um sistema de expressão transitória de protoplastos de repolho.

Para realizar a resposta de hipóxia induzida por submersão no nível celular, várias metodologias de eliminação de oxigênio foram empregadas em estudos anteriores para simular ambientes hipóxicos. Isso inclui o uso de EC-Oxyrase, OxyFluor, sulfito de sódio e bolsas consumidoras de oxigênio. A EC-Oxirase é normalmente usada para tratamento anaeróbico em linhagens celulares humanas¹² e protoplastos Arabidopsis ¹³. O OxyFluor foi considerado eficaz na mitigação do fotobranqueamento causado por espécies reativas de oxigênio durante a imagem de fluorescência de células vivas^14,15. O sulfito de sódio tem sido empregado no tratamento anaeróbio de nematóides¹⁶ e, mais recentemente, em protoplastos de arroz, em conjunto com técnicas como ensaios de imunoprecipitação da cromatina (ChIP)¹⁷. Pacotes absorvedores de oxigênio, usados principalmente para cultura bacteriana anaeróbica¹⁸, também demonstraram eficácia na indução da ativação de promotores de ZmPORB1 em protoplastos de milho sob condições anaeróbias¹⁹.

O presente trabalho tem como objetivo estabelecer um pipeline robusto para isolamento e expressão transitória de protoplastos de repolho. Posteriormente, a eficácia de vários tratamentos de ajuste de oxigênio foi avaliada avaliando a atividade promotora de genes de resposta anaeróbica usando ensaios de luciferase dupla. Prevê-se que o protocolo desenvolvido neste estudo seja valioso para futuras pesquisas relacionadas ao estresse de submersão ou hipóxia em sistemas Brassica .

Protocolo

Duas cultivares comerciais de repolho (B. oleracea var. capitata) foram utilizadas neste estudo: 'Fuyudori' e '228'. Uma representação gráfica do fluxo de trabalho do protocolo é mostrada na Figura 1. Os detalhes dos reagentes e dos equipamentos utilizados neste estudo estão listados na Tabela de Materiais.

1. Preparação de mudas de repolho

1. Semeie sementes de repolho 'Fuyudori' e '228' usando substrato de planta comercial em orifícios redondos quadrados (D 4,5 cm x H 4,5 cm) de bandejas de 48 poços (L 49 cm x W 28 cm x H 5 cm). Incorpore as sementes com aproximadamente 1 cm de profundidade no meio de cultivo.
2. Cultive mudas de repolho em uma sala de crescimento a 22 ° C com um ciclo claro-escuro de 16/8 h. Manter a intensidade luminosa de 100 μmol ^m-2·^s-1 (tubo fluorescente branco) durante a fase de luz.
3. Após 2-3 semanas de crescimento, use mudas de repolho no estágio de 2 folhas para posterior isolamento do protoplasto do mesofilo.
   NOTA: O tamanho sugerido das mudas de repolho é um estágio de 2 folhas, no qual a segunda folha verdadeira é totalmente expandida, mas a terceira folha verdadeira não é expandida e seu comprimento é menor que 1 cm (Figura 2A). Para sincronizar os estágios de desenvolvimento das mudas de repolho, as sementes de 'Fuyudori' precisam ser semeadas aproximadamente 2 dias antes das sementes de '228' devido às suas diferentes taxas de crescimento. Esse ajuste garante crescimento e maturidade uniformes entre as plantas de repolho no estágio desejado.

2. Isolamento de protoplastos de repolho

1. Prepare 12,5 mL de solução enzimática (Tabela 1) antes de cada isolamento do protoplasto.
   1. Pré-aqueça uma solução com 10 mM MES (pH 5,7) e 0,6 M de manitol a 55 °C. Continue aquecendo a solução a 55 °C por 10 min após adicionar 1,5% de Celulase R10 e 0,75% de Macerozyme R10.
   2. Depois que a solução enzimática esfriar até a temperatura ambiente (25 ° C), adicione 10 mM de CaCl₂ e 0,1% de albumina de soro bovino (BSA). Esterilizar o filtro da solução enzimática preparada para uma placa de Petri de 9 cm utilizando um filtro de seringa de 0,22 μm.
      NOTA: O pré-aquecimento da solução aumenta a solubilidade enzimática e inativa a protease. Os efeitos da digestão variam dependendo dos diferentes tipos de enzimas celulase. A combinação de Cellulase R10 e Macerozyme R10 é adequada para isolamento de protoplastos de repolho.
2. Colete as segundas folhas verdadeiras recém-expandidas de cinco a oito mudas de repolho e corte-as em tiras de 0,5-1,0 mm usando uma lâmina de barbear afiada. Transfira imediatamente as tiras de folhas para a solução enzimática recém-preparada.
   NOTA: Selecionar folhas saudáveis e designadas do repolho no estágio adequado é crucial. As segundas folhas verdadeiras recém-expandidas de mudas de repolho no estágio de 2 folhas fornecem a maior eficiência de isolamento de protoplastos. Plantas maduras demais, cotilédones ou folhas envelhecidas não são recomendados para isolamento de protoplastos. Cinco a doze folhas verdadeiras bem expandidas podem produzir protoplastos de repolho com sucesso em 12,5 mL de solução enzimática. O número de folhas necessárias para o isolamento do protoplasto depende da quantidade desejada de protoplastos necessários. Normalmente, os protoplastos obtidos de cinco a oito folhas são suficientes para procedimentos experimentais subsequentes.
3. Após infiltração a vácuo no escuro por 30 min (Figura 2B), mantenha as tiras de folhas de repolho imersas na solução enzimática (Figura 2C) no escuro em temperatura ambiente por mais 4-16 h.
   NOTA: O tempo de digestão enzimática pode variar entre as cultivares de repolho e deve ser otimizado de acordo com o genótipo específico. Por exemplo, 'Fuyudori' requer um tempo de digestão mais longo (16 h) em comparação com '228' (4 h) devido às folhas mais grossas de 'Fuyudori'.
4. Dilua a solução contendo protoplastos com um volume igual de solução W5, que consiste em 2 mM de MES (pH 5,7), 154 mM de NaCl, 125 mM de CaCl₂, 5 mM de KCl e 5 mM de glicose (consulte a Tabela 1 para preparação), para interromper a digestão enzimática.
5. Solte a suspensão do protoplasto girando suavemente ou usando um agitador orbital. Filtrar a suspensão celular através de um filtro de células de 70 μm para um tubo cónico de 50 ml.
   NOTA: Os protoplastos isolados são capazes de passar por um filtro de células de 70 μm, enquanto os restos vegetais não digeridos são retidos pelo filtro e posteriormente removidos da suspensão. Os filtros celulares podem ser reutilizados e mantidos em etanol a 75% após a lavagem, mas é necessário enxaguar totalmente os filtros celulares com solução W5 para remover o etanol residual antes do uso.
6. Centrifugar a solução de protoplastos com 150 x g durante 2 min a 4 °C e retirar cuidadosamente o sobrenadante. Lave suavemente os protoplastos peletizados adicionando 10 mL de solução W5 ao longo da parede do tubo cônico a uma taxa de fluxo aproximada de 1 mL · ^s-1. Centrifugar o tubo a 150 x g durante 2 min a 4 °C e repetir este procedimento de lavagem novamente para garantir a remoção completa da solução enzimática.
7. Ressuspenda os protoplastos na solução W5 e coloque-os no gelo por 30 min. Após a incubação do gelo, remova o sobrenadante com uma pipeta de 1 mL de cada vez até que todo o sobrenadante seja removido.
8. Ressuspenda os protoplastos em uma solução MMG pré-resfriada com gelo composta de 4 mM de MES (pH 5,7), 0,4 M de manitol e 15 mM de MgCl₂ (consulte a Tabela 1 para preparação).
9. Meça a concentração de protoplastos com um hemocitômetro e ajuste a concentração final para 4 x 10⁵ protoplastos · ^mL-1 usando solução MMG.

3. Transfecção de protoplastos

1. Misture um volume total de 10 μL de plasmídeo (5-10 μg) (Arquivo Suplementar 1) com 100 μL de protoplastos (4 x 10⁴ protoplastos) e coloque no gelo por 10 min.
   NOTA: Para purificação de plasmídeo de grau de transfecção, um kit de plasmídeo disponível comercialmente é usado seguindo as instruções do fabricante. Aproximadamente 4 x 10⁴ protoplastos são normalmente empregados em um ensaio repórter de luciferase dupla. Para experimentos em larga escala, uma quantidade maior de protoplastos está disponível para transfecção. Especificamente, cerca de 2 x 10⁵ protoplastos transfectados com 10 μg de plasmídeo exibem uma eficiência de transfecção comprovada variando de 30% a 40%.
2. Adicione um volume igual (110 μL) de solução de PEG recém-preparada (consulte a Tabela 1 para preparação) contendo 40% de polietilenoglicol 4000 (PEG4000), 0,1 M de CaCl₂ e 0,2 M de manitol na solução de protoplasto e misture suavemente.
3. Incubar a mistura de protoplastos à temperatura ambiente no escuro durante 10 min, depois adicionar 440 μL de solução W5 para terminar a reacção.
4. Centrifugue os protoplastos transfectados a 150 x g por 2 min a 4 ° C e ressuspenda o pellet em 750 μL de solução W5 enriquecida com oxigênio. Transfira os protoplastos ressuspensos para uma placa de cultura de tecidos de 6 poços pré-revestida com 1% de BSA.
   NOTA: A solução W5 usada para incubação celular deve ser borbulhada com oxigênio usando um concentrador de oxigênio (~ 90% de oxigênio) conectado a uma pedra de ar por 5 min (Figura 2D). Após este processo de oxigenação, a concentração final de oxigênio dissolvido na solução W5 aumentou de 7,84 mg· ^L-1 ± 0,05 mg· ^L-1 a 29,18 mg· ^L-1 ± 0,43 mg· ^L-1, medido com um medidor de oxigênio dissolvido. O volume da solução W5 para ressuspensão do protoplasto transfectado depende do tipo de placa de cultura de células teciduais utilizada. Para placas de cultura de células de 12 ou 24 poços, é aconselhável reduzir o volume da solução W5 para mitigar o estresse por hipóxia durante a incubação devido à profundidade mais profunda dentro dos poços. Para o revestimento BSA, cada poço da placa de cultura recebeu 1 mL de solução BSA a 1%, que foi revestida por 10 s. A solução BSA foi então descartada de cada poço, e os poços foram posteriormente reabastecidos com solução W5. Este procedimento teve como objetivo criar uma superfície temporária não aderente usando BSA, evitando efetivamente que os protoplastos aderissem à superfície plástica da placa de cultura durante as etapas experimentais subsequentes.

4. Tratamento da hipóxia em protoplastos de repolho

1. Realizar tratamentos de hipóxia induzida química ou fisicamente imediatamente após a transfecção de protoplastos.
   NOTA: Recomenda-se que o tratamento da hipóxia seja aplicado imediatamente após a transfecção do protoplasto. A incubação prolongada de protoplastos pode diminuir a resposta subsequente à hipóxia.
   1. Para hipóxia quimicamente induzida em protoplastos de repolho, adicione OxyFluor, EC-Oxyrase e sulfito de sódio à solução de protoplasto W5.
      NOTA: Usando 0,6 unidades · ^mL-1 EC-oxirase, 0,6 unidades · ^mL-1 OxyFluor e 1 g · ^mL-1 sulfito de sódio em W5 foram as condições testadas capazes de induzir o promotor BoADH1 e BoSUS1L (Figura 3A) com baixo dano à integridade do protoplasto nas duas variedades de repolho examinadas.
   2. Para hipóxia induzida por bolsa que consome oxigênio, coloque dois pacotes de absorvedores de oxigênio em um frasco anaeróbico de 3,5 L para criar um ambiente hipóxico.
2. Colha protoplastos tratados com hipóxia centrifugando a 150 x g por 2 min a 4 ° C. Congelar os protoplastos coletados com nitrogênio líquido e armazená-los em um freezer a -80 °C para ensaios subsequentes.

5. Ensaio de luciferase dupla

1. Realize o ensaio repórter de luciferase dupla de acordo com as instruções do fabricante com pequenas modificações.
   1. Ressuspenda os protoplastos de repolho em 50 μL de tampão de lise passiva 1x e vórtice por 10 s.
   2. Incubar protoplastos interrompidos em gelo por 10 min e coletar o sobrenadante após centrifugação a 10.000 x g por 10 min a 4 ° C.
   3. Adicione 20 μL de lisado celular a cada poço da microplaca. Dispense 100 μL de reagente II do ensaio de luciferase nos poços e meça a atividade da luciferase do vaga-lume usando um leitor de microplacas.
   4. Adicione 100 μL do reagente de ensaio disponível comercialmente a cada poço e meça a atividade da luciferase de Renilla usando um leitor de microplacas.

Resultados

Este trabalho desenvolveu com sucesso um sistema de expressão transitória utilizando protoplastos de repolho (consulte a Figura 1 para fluxo de trabalho). Os protoplastos foram isolados de folhas verdadeiras de repolho de 2 a 3 semanas de idade de tamanho apropriado (Figura 2A) das cultivares comerciais de repolho 'Fuyudori' e '228' usando digestão de celulase / macerozima e infiltração a vácuo escuro (

Discussão

Este protocolo apresenta um método simplificado para isolamento de protoplastos de duas cultivares comerciais de repolho. A eficácia deste método é avaliada principalmente por meio de dois parâmetros críticos de controle de qualidade: o rendimento de protoplastos viáveis e a eficiência da transfecção de protoplastos. A implementação deste protocolo resultou em um rendimento superior a 4,00 x 10⁶ protoplastos · g ^{− 1} · FW do tecido mesofilo de ambas a...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
2-(N-morpholino) ethanesulfonic Acid (MES)	PhytoTech Labs	M825	For enzyme solution preparation
228 cabbage seeds	Takii & Co., Ltd. (Kyoto, Japan)
50 mL Conical Tube	SPL Life Sciences	50050	For enzyme solution preparation
6-well tissue culture plate	Alpha Plus	16106	For protoplast incubation
70 μm cell strainer	Sorfa	SCS701	For protoplast filtration
9-cm Petri dish	Alpha Plus	16001	For enzymatic digestion
Anaerobic jar	HIMEDIA	Anaerobic Jar 3.5 L	For hypoxia treatment
Bovine serum albumin	Sigma-Aldrich	A7906	For W5 solution preparation and culture plate coating
Calcium chloride	J.T.Baker	131301	For W5 solution and PEG solution preparation
Cellulase R10	Yakult		For enzyme solution preparation
Desiccator	Tarsons	402030	For vacuum infiltration
D-Glucose	Bioshop	GLU501	For W5 solution preparation
Dissolved oxygen meter	Thermo Scientific	Orion Star A223	For oxygen measurement
D-Mannitol	Sigma-Aldrich	M1902	For enzyme solution, PEG solution, and MMG solution preparation
Dual-Luciferase Reporter Assay System	Promega	E1960	For Dual-luciferase reporter assay
EC-Oxyrase	Oxyrase Inc.	EC-0005	For hypoxia treatment
Fuyudori cabbage seeds	Kobayashi Seed Co., Ltd. (Kakogawashi, Japan)
High-Speed refrigerated centrifuge	Hitachi	CR21GIII	For protoplast harvest
Macerozyme R10	Yakult		For enzyme solution preparation
Magnesium chloride	Alfa Aesar	12315	For MMG solution preparation
Microcentrifuge	Hitachi	CT15RE	For protoplast harvest
Microplate	Greiner	655075	For Dual-luciferase reporter assay
Microplate Reader	Molecular Devices	SpectraMax Mini	For Dual-luciferase reporter assay
Millex 0.22 μm syringe filter	Merck	SLGP033RS	For enzyme solution preparation
Oil Free Vacuum Pump	Rocker	Rocker 300	For vacuum infiltration
OxyFluor	Oxyrase Inc.	OF-0005	For hypoxia treatment
Oxygen absorber pack	Mitsubishi Gas Chemical Company	AnaeroPack, MGCC1	For hypoxia treatment
Oxygen concentrator	UTMOST PERFECT	AII-X	For oxygen-bubbling in W5 solution
Plant substrate	Klasmann-Deilmann	Potgrond H substrate	For cabbage seedlings preparation
Plasmid Midi Kit	QIAGEN	12145	For purification of transfection-grade plasmid DNA
Polyethylene Glycol 4000	Fluka	81240	For protoplast transfection
Potassium chloride	J.T.Baker	304001	For W5 solution preparation
Razor blade	Gillette		For cabbage leaf strips preparation
Sodium chloride	Bioshop	SOD002	For W5 solution preparation
Sodium sulfite	Sigma-Aldrich	S0505	For hypoxia treatment
Water Bath	Yihder	BU-240D	For enzyme solution preparation