Teste de eficiência de tradução usando perfis polissômicos sob estresse térmico

Resumo

O protocolo aqui apresentado envolve o perfil polissômico para isolar translatome, mRNAs associados a ribossomos, em RNAs não polissomais e polissomais de Arabidopsis por meio de centrifugação por gradiente de densidade de sacarose. Este método demonstra a eficiência de tradução de Arabidopsis estressada pelo calor.

Resumo

O controle translacional de diferentes genes sob estresse térmico é uma etapa crítica para a adaptação das plantas ao ambiente. Avaliar as atividades translacionais de vários genes pode nos ajudar a entender os mecanismos moleculares subjacentes à resiliência das plantas, contribuindo para o desenvolvimento de culturas com maior tolerância ao estresse diante das mudanças climáticas globais. Este trabalho apresenta uma metodologia detalhada para avaliar a eficiência da tradução por meio de perfis polissômicos em plantas expostas ao estresse térmico. O procedimento é dividido em três partes: tratamento de estresse térmico para Arabidopsis, teste de eficiência de tradução usando perfis polissômicos e cálculo da eficiência de tradução isolando RNA não polissômico e polissômico com base no perfil. Na primeira parte, as plantas de Arabidopsis são submetidas a condições controladas de estresse térmico para mimetizar os desafios ambientais. O tratamento envolve a exposição das plantas a altas temperaturas por períodos especificados, garantindo uma indução de tensão consistente e reprodutível. Esta etapa é crucial para estudar as respostas fisiológicas e moleculares da planta ao estresse térmico. A segunda parte envolve o teste de eficiência de tradução usando perfis polissômicos. Os polissomas são extraídos por centrifugação por gradiente de sacarose, que separa os mRNAs com base na carga ribossômica. Isso permite o exame da ocupação do ribossomo em mRNAs, fornecendo informações sobre os mecanismos de controle translacional sob condições de estresse. Na terceira parte, o RNA é isolado de frações polissomais e não polissomais. O RNA spike-in é usado para medir com precisão a quantidade de RNA em cada fração. O cálculo da eficiência da tradução é realizado comparando a distribuição de mRNAs entre essas frações em condições normais e de estresse térmico. As atividades de tradução de genes específicos são avaliadas posteriormente pela realização de PCR quantitativo em tempo real (qRT-PCR) com RNA associado ao ribossomo e RNA total. Esta metodologia foca-se exclusivamente nos efeitos do stress térmico, fornecendo um protocolo detalhado para análise da regulação translacional em plantas.

Introdução

A tradução é crucial para os organismos sintetizarem proteínas funcionais a partir do mRNA, apoiando funções celulares essenciais e processos biológicos como metabolismo e sinalização e permitindo respostas ao estresse. Sem tradução, as células não podem produzir proteínas vitais, impactando sua estrutura, função e regulação, afetando assim a sustentação da vida e promovendo a diversidade biológica ^1,2. Portanto, estudar a eficiência translacional das plantas é crucial. A tradução envolve várias etapas essenciais. Primeiro, a iniciação ocorre quando o mRNA se liga a um ribossomo, facilitado por fatores de iniciação, como eIFs em eucariotos, que identificam o códon de início, normalmente AUG. Em seguida, o alongamento prossegue à medida que as moléculas de RNA de transferência (tRNA), cada uma carregando aminoácidos específicos, se ligam sequencialmente ao ribossomo. As ligações peptídicas se formam entre os aminoácidos adjacentes, alongando a cadeia polipeptídica de acordo com a sequência de mRNA. Finalmente, a terminação é iniciada ao encontrar um códon de parada (UAA, UAG ou UGA), reconhecido por fatores de liberação que levam o ribossomo a liberar a proteína recém-sintetizada. Ao longo da tradução, vários fatores de iniciação eucariótica (eIFs), fatores de alongamento e RNAs ribossômicos trabalham juntos para garantir precisão e eficiência ^3,4.

Estudos anteriores indicaram que as modificações pós-traducionais desempenham um papel crítico na regulação das interações entre os eIFs e, portanto, influenciam a eficiência da tradução. Pesquisas in vitro revelaram que a CASEÍNA QUINASE 2 (CK2) quinase fosforila eIF3c, eIF5 e eIF2β para aumentar suas interações entre si e com eIF1 ^5,6. No escuro, a ligase E3 CONSTITUTIVAMENTE FOTOMORFOGÊNICA 1 (COP1) reprime a tradução inibindo a fosforilação mediada por TOR de S6K-RPS6. O RPS6 não fosforilado é incapaz de formar ribossomos funcionais, interrompendo assim a tradução⁷. Por outro lado, sob condições de luz, o SUPRESSOR DE PHYA 105 (SPA1) quinase fosforila eIF2α para facilitar a montagem do complexo eIF2 e promover o início da tradução⁸. Essas descobertas destacam os complexos mecanismos de controle que regulam a tradução em resposta a sinais ambientais.

Estímulos ambientais moderados podem efetivamente promover processos translacionais para facilitar o crescimento, como a fotomorfogênese ^8,9. No entanto, quando os fatores ambientais são excessivos, as plantas imóveis precisam desenvolver mecanismos regulatórios adequados para mitigar os danos causados pelo estresse ambiental¹⁰. Em estudos anteriores relacionados às respostas ao estresse das plantas, a maioria se concentrou na regulação nos níveis metabólico, hormonal e transcricional 11,12,13,14. No entanto, pesquisas recentes começaram a destacar a influência da regulação translacional na tolerância ao estresse da planta 15,16,17. As plantas podem aumentar sua tolerância ao estresse reduzindo a eficiência translacional, minimizando assim o consumo desnecessário de energia. Devido à formação de grânulos de estresse não membranoso nas células vegetais, o mRNA não traduzido e as proteínas associadas se agregam dentro deles para reduzir a eficiência translacional¹⁸. Um dos estresses ambientais comuns que as plantas costumam encontrar é o estresse térmico, que foi relatado como indutor da formação de grânulos de estresse dentro das células vegetais^19,20. O aumento global das temperaturas médias devido ao aquecimento global afeta severamente o rendimento das culturas²¹. Portanto, estudar a regulação fisiológica de plantas sob estresse térmico é crucial. Um estudo anterior mostrou que o tratamento térmico do trigo resultou em uma diminuição no mRNA ligado ao polissomo. No entanto, os mRNAs armazenados em grânulos de estresse foram liberados e religados aos ribossomos, facilitando a tradução após a recuperação²². Além disso, pesquisas anteriores compararam a expressão gênica entre o mRNA total e o mRNA ligado ao polissomo em plantas submersas¹⁶. Os resultados indicaram que os níveis de mRNA no estado estacionário associados ao ácido abscísico e às respostas ao estresse abiótico aumentaram ligeiramente após a submersão. Além disso, a quantidade de mRNAs ligados ao polissomo aumentou significativamente. Esses resultados sugerem que a regulação da tradução pode desempenhar um papel mais crítico no controle da tolerância ao estresse em plantas. Portanto, um método eficaz de isolamento de RNA polissômico é crucial para estudar o translatômio de amostras tratadas com estresse.

Neste protocolo, modificamos o método de isolamento de RNA da extração de fenol/clorofórmio volumosa e de alto risco com método de precipitação de LiCl para o método de extração de tiocianato de fenol/guanidínio em pequena escala, que requer menos volume. O primeiro método envolve a mistura direta com frações polissomais, resultando em um resíduo experimental maior ^9,15,23. Em contraste, essa abordagem modificada utiliza princípios de densidade diferencial: o RNA polissômico é primeiro misturado com uma solução sem açúcar com alto teor de sal e depois precipitado por ultracentrifugação. Posteriormente, a extração de RNA é realizada usando um pequeno volume de reagente tiocianato de fenol/guanidínio. Este método reduz efetivamente a geração de resíduos orgânicos, tornando nosso experimento mais ecológico. Além disso, os solventes orgânicos utilizados apresentam menor toxicidade. Essas razões nos levaram a ajustar e melhorar os procedimentos experimentais de acordo. Além disso, os métodos anteriores não forneciam um protocolo abrangente para calcular as eficiências de tradução usando a normalização de pico, o que é essencial para análises translatômicas mais aprofundadas.

Aqui, descrevemos o perfil polissômico e o protocolo de isolamento de RNA polissômico para investigar a eficiência da tradução e análises translatômicas em Arabidopsis sob estresse por choque térmico. Este protocolo foi empregado para avaliar a eficiência da tradução no tipo selvagem Col-0 em condições normais, de choque térmico e pós-recuperação. Os resultados do perfil polissômico e a porcentagem de RNA polissômico revelaram alterações na eficiência da tradução após o tratamento com estresse térmico em mudas de Arabidopsis .

Protocolo

1. Preparação de amostra de mudas de Arabidopsis tratada com estresse térmico

1. Plaquear 250 sementes para cada repetição e cada condição com um conta-gotas no papel de filtro colocado na placa de ágar meio basal Murashige e Skoog (MS) sem sacarose (pH 5,6) suplementada com 1,2% de fitoágar.
   NOTA: Para plantar mudas em placas MS, papel de filtro estéril é colocado na placa para evitar que as raízes das mudas penetrem profundamente no meio, facilitando a amostragem. As sementes são então plantadas em cima do papel de filtro. Para excluir a influência dos açúcares no crescimento das plantas e nos resultados experimentais, recomenda-se o uso de um meio MS que não contenha sacarose para o cultivo.
2. Enrole a placa MS contendo sementes plantadas com papel alumínio para bloquear a luz e incube-a a 4 ° C por 2 dias para induzir a vernalização.
3. Transferir as sementes vernalizadas para uma câmara de crescimento a ser cultivada a 16 h: 8 h, fotoperíodo claro-escuro a 22 °C com uma intensidade de luz de 100 μmol/m²/s.
4. Para amostras de estresse térmico, sele as placas médias MS contendo mudas de 5 dias com fita adesiva à prova d'água e coloque-as em banho-maria a 40 ° C por 1 h.
5. Para amostras que se recuperam após o tratamento térmico, resfrie as placas imediatamente após o tratamento térmico. Em seguida, colocá-los em uma câmara de crescimento a 22 °C por 2 h.
6. Colha 250 mudas tratadas ou não em tubos de microcentrífuga de 1,5 mL para cada repetição e congele as amostras em nitrogênio líquido imediatamente.
   NOTA: Para cada condição, foram preparados dois grupos de amostras. Um é para as análises de perfil polissômico e o outro é para a extração de RNA não polissômico e polissomal.

2. Preparação do gradiente de sacarose

1. Preparar a solução gradiente contendo as seguintes concentrações de sacarose: 12,5%, 24,4%, 36,3%, 48,1% e 60%. A composição da solução inclui 50 mM de Tris-HCl, 25 mM de KCl, 10 mM de MgCl₂, 100 μg/mL de heparina e 50 μg/mL de cicloheximida (CHX).
2. Carregue as soluções de gradiente de alta para baixa concentração, começando de baixo para cima. Depois de adicionar cada concentração de solução de gradiente, congele a solução para um estado sólido antes de adicionar a próxima concentração. Para cada concentração de gradiente de sacarose, adicione 2,2 mL. Este processo resultará em um gradiente de densidade de sacarose descontínuo.
3. Conservar temporariamente o gradiente de sacarose preparado a -80 °C e descongelar durante a noite a 4 °C antes de utilizar.

3. Preparação da amostra de perfil de polissomo

1. Moer 250 mudas Col-0 de 5 dias, estressadas pelo calor ou não, que foram previamente congeladas em pó usando um homogeneizador a uma frequência de 30 ciclos/s por 1 min.
   NOTA: Quando o número de plantas com o mesmo fundo é igual, elas têm o mesmo rendimento de extração de RNA. No entanto, ao comparar plantas transgênicas ou mutantes superexpressas com diferentes origens, a quantidade de plantas utilizadas deve ser ajustada de acordo com as condições da planta.
2. Para obter uma solução de extração contendo RNA não polissômico e polissomal, adicione 500 μL de tampão de extração polissômica (200 mM Tris-HCl, pH 8,0, 50 mM KCl, 25 mM MgCl₂, 50 μg / mL cicloheximida, 100 μg / mL de heparina, 2% PTE, 10% DOC, 400 U / mL Inibidor de ribonuclease) a cada tubo e misture as amostras por inversão e vórtice. Certifique-se de que as amostras sejam mantidas a 4 °C durante todo o processo.
3. Centrifugar a solução de extracção a 4 °C, 12.000 x g durante 10 min. Em seguida, filtrar o sobrenadante através de um filtro de células de 100 μm para obter uma solução de extracção límpida e sem partículas.
   NOTA: As partículas presentes na solução de extração podem sedimentar durante a ultracentrifugação, potencialmente formando um pellet que pode afetar a precisão das medições de perfil de polissomo.
4. Carregar o sobrenadante filtrado num gradiente de sacarose pré-preparado e assegurar que atinge o equilíbrio.
   NOTA: Devido à alta velocidade de rotação da ultracentrífuga, é essencial garantir a segurança e o bom funcionamento da ultracentrífuga. Para conseguir isso, é necessário confirmar que os pesos da amostra são idênticos antes da rotação. Portanto, utilizamos uma balança de precisão para verificar se os pesos dos gradientes são completamente uniformes.
5. Centrifugar o gradiente de sacarose carregado com amostras a 4 °C, 210.000 x g durante 3,5 h utilizando um rotor de balde oscilante por ultracentrifugação. Defina as taxas de aceleração e desaceleração para o máximo. Após a ultracentrifugação, o RNA não polissômico e polissômico é distribuído de acordo com sua densidade na solução de gradiente de sacarose correspondente.
   NOTA: No gradiente de sacarose, o RNA não polissômico com menor densidade se distribui na camada superior, enquanto o RNA polissomal, caracterizado por maior densidade devido à presença de numerosos ribossomos envolvidos na tradução ativa no mRNA, se distribui na camada inferior. Posteriormente, o perfil de polissomos pode ser medido usando um fracionador de gradiente de densidade.

4. Análise de perfil de polissomos

NOTA: Um fracionador de gradiente de densidade com uma bomba de seringa de microvolume é usado para medir o perfil de polissomas.

1. Prepare a solução de perseguição (70% de sacarose, 10% de glicerol e 0,02% de azul de bromofenol) para a bomba de seringa de microvolume.
2. Use o software para controlar o fracionador de gradiente de densidade. Calibre a máquina usando água deionizada. Após a calibração, use-o para realizar o perfil de polissomos.
   1. Para realizar o ajuste da linha de base, ligue o UV/VISDetector até que a luz mude de vermelho para verde. Ajuste o botão Deslocamento do gravador para alinhar a linha do marcador e, em seguida, gire o botão Ajuste da linha de base para a posição aberta mínima. Defina o botão Sensibilidade no UV/VISDETECTOR para o nível 2.0 e pressione o botão Auto Baseline . Por fim, use o botão Recorder Offset para ajustar a linha de base desejada para 20. O processo calibrado varia de acordo com a marca do mecanismo e as diferentes amostras.
3. Após a ultracentrifugação, coloque os tubos com as amostras no fracionador de gradiente de densidade usando o sistema de perfuração do tubo para que o tubo possa ser conectado à bomba de seringa com a solução de perseguição e o detector UV.
4. Mude o fracionador de gradiente de densidade para o modo de controle de software (REMOTE) e defina a taxa de fluxo de injeção da bomba de seringa de microvolume para 3 mL / min.
5. Inicie as configurações do software para iniciar e obter o gráfico de perfil de polissomo usando o fracionador medindo OD₂₅₄.

5. Isolamento de RNA não polissômico e polissômico

NOTA: Para esta parte do protocolo, um grupo diferente de amostras do mesmo lote foi usado após a realização da ultracentrifugação seguindo as mesmas etapas descritas anteriormente.

1. Com base nos resultados da medição do perfil polissômico, coletar as frações de RNA não polissômica e polissômica separadamente. Calcular os volumes de solução para as fracções não polissómicas e polissómicas e recolher a fracção não polissómica (parte superior).
   NOTA: De acordo com os perfis, a fração com mais de dois ribossomos é definida como uma fração polissomal, enquanto a fração com os picos de rRNA 40S, 60S e 80S é definida como uma fração não polissomal.
2. Misture bem as frações alvo de RNA com solução pré-fria 2x com alto teor de sal (400 mM Tris-HCl, pH 8,0, 100 mM KCl, 50 mM MgCl₂).
3. Adicione 8 μL de estoque diluído de controle de RNA poli-A eucariótico do kit.
   NOTA: Para a normalização de pico necessária para a sétima etapa. O Kit de Controle de RNA Poli-A Eucariótico inclui genes de B. subtilis , como o gene DAP , que não estão presentes nas plantas, como genes de referência. Para determinar a proporção de perda do gene de referência durante a reação após a extração, adicione uma quantidade igual do reagente contendo amostra de RNA do gene DAP a diferentes tubos com RNA não polissômico ou polissômico antes da extração. Isso permite a determinação da proporção de perda de genes de referência durante a reação após a extração e pode ser usado para fins de normalização.
4. Centrifugue a solução de alto teor de sal de RNA misturado a 4 °C, 450.000 x g, por 5 h usando um rotor de balde oscilante de ultracentrífuga.
5. Após a ultracentrifugação, o RNA precipitará na parte inferior do tubo da centrífuga. Despeje cuidadosamente o sobrenadante de cima para preservar o pellet de RNA na parte inferior.
6. Lave rapidamente o pellet de RNA com 500 μL de água tratada com dietilpirocarbonato (DEPC) pré-frio, repetindo esta etapa 3x.
   NOTA: Para evitar que a água tratada com DEPC dissolva novamente o RNA durante o processo de lavagem, é necessário pré-resfriar a água tratada com DEPC antes do uso para reduzir sua solubilidade. Além disso, o tempo de contato entre a água tratada com DEPC e o pellet de RNA durante a lavagem deve ser minimizado.

6. Extração de RNA não polissômico e polissômico

1. Adicione 500 μL de reagente de extração de RNA e misture com a amostra de RNA a ser extraída. Incubar por 10 min.
2. Adicione 100 μL de clorofórmio, misture bem e incube por 10 min para separação de fases.
3. Centrifugue a mistura de reação a 4 °C, 12.000 x g por 10 min. Transfira a camada aquosa clara superior contendo RNA para um novo tubo, misture-a suavemente com um volume igual de isopropanol e incube a -20 ° C por 2 h para precipitação de RNA.
4. Após a precipitação, centrifugue a 4 °C, 12.000 x g por 10 min. Descarte cuidadosamente o sobrenadante e retenha o pellet de RNA na parte inferior.
5. Lave o pellet de RNA com 1 mL de etanol a 75% pré-resfriado. Centrifugue a 4 °C, 12.000 x g por 10 min, descarte o sobrenadante e seque ao ar o pellet de RNA.
6. Uma vez que o pellet de RNA esteja seco, ressuspenda o pellet de RNA em 30 μL de água tratada com DEPC e meça a concentração de RNA (OD₂₆₀) usando um espectrofotômetro de espectro completo (220 nm-750 nm).

7. Normalização de pico

1. Use 1000 ng de RNA extraído para transcrição reversa feita usando um kit qPCR seguindo as instruções do fabricante. Tanto o RNA não polissômico quanto o polissômico precisam ser transcritos reversamente em cDNA.
2. Misture 1 μL de cDNA com primers do gene DAP e use o tampão SYBR para medir o nível de expressão do gene alvo de acordo com as instruções do fabricante. Em seguida, use PCR em tempo real para detectar a expressão do gene DAP .
   NOTA: As sequências dos primers do gene DAP são as seguintes:
   Primer direto = 5'-ATA AAA GAA TTC AGC TAA CGC TTC C-3'
   Primer reverso = 5'-TTG TTT CTT TGC CTC TAT TGT ATC C-3'
3. Comparar os níveis de expressão dos genes DAP nos grupos de RNA não polisssomal e polissômico medidos e estimar o conteúdo de RNA em condições de perda proporcional. Usando o conteúdo de RNA normalizado, calcule a proporção de RNA em polissomos.

Resultados

O tipo selvagem de Arabidopsis, Col-0, foi cultivado em meio MS sob fotoperíodo de luz de 16 h:8 h. Para o controle, foram utilizadas mudas com 5 dias de idade, sem tratamento por estresse térmico. O grupo de estresse térmico foi submetido a 1 h de tratamento térmico a 40 °C em banho-maria pré-aquecido, enquanto o grupo de recuperação foi colocado a 22 °C por 2 h imediatamente após o tratamento térmico. Ao empregar diferentes condições de tratamento térmico e condi...

Discussão

Este protocolo descreve um método simples e padronizado para medir a eficiência de tradução de mudas de Arabidopsis. As etapas críticas deste protocolo são garantir a estabilidade do RNA com centrifugação secundária e extração de reagente de extração de RNA, bem como a preparação meticulosa do gradiente de sacarose. Além disso, fornecemos etapas críticas para normalizar e quantificar o RNA não polissômico e polissômico com o método de normalização spike-in. É muit...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
1.5 mL eppendorf tube	Labcon	3012-870-000-9	RNA extraction
13.2 mL centrifuge tube	Beckman Coulter	331372	ultracentrifugation
Bromophenol blue	Honeywell	32712	Polysome profile
Chloroform	Honeywell	32211	RNA extraction
Cycloheximide (CHX)	Sigma-Aldrich	SI-C7698	Polysome profile
Diethyl pyrocarbonate (DEPC)	Sigma-Aldrich	D5758	RNA extraction
Ethanol	Sigma-Aldrich	32221	RNA extraction
GeneChip Eukaryotic Poly-A RNA Control Kit	Invitrogen	900433	Normalization
Glycerol	Honeywell	15523	Normalization
Heparin	Sigma-Aldrich	SI-H3149	Polysome profile
HiScript III RT SuperMix for qPCR kit	Vazyme	R323-01	Normalization
KCl	J.T.Baker	3040-01	Polysome profile
MgCl2	Sigma-Aldrich	SI-M8266	Polysome profile
MS basal medium	Phyto	M524	Plant culture
Peak Chart Syringe Pump	Brandel	SYN4007LS	Polysome profile
Polyoxyethylene-10-Tridecyl-Ether (PTE)	Sigma-Aldrich	P2393	Polysome profile
RNasin	Promega	N251B	Polysome profile
Sodium deoxycholate (DOC)	Sigma-Aldrich	SI-D6750	Polysome profile
Sucrose	Sigma-Aldrich	S5391	Polysome profile
SYBR Green Supermix	Bio-Rad	BP170-8882	Normalization
TRI reagent	MRC	TR118	RNA extraction
Tris-HCl	J.T.Baker	4109-06	Polysome profile
Ultracentrifuge	Beckman Coulter	Optima L-100K	ultracentrifugation
UV/VISDETECTOR	Brandel	UA-6	Polysome profile