Tornando-Patch pipetas e Eletrodos Sharp com um extrator programável

Resumo

Este vídeo mostra como usar um extrator programáveis ​​para fazer pipetas patch e eletrodos afiada para eletrofisiologia. O mesmo procedimento pode ser usado para fazer uma variedade de ferramentas de vidro, inclusive agulhas de injeção.

Resumo

Microeletrodos de vidro (também chamado de pipetas) ter sido um cavalo de batalha da eletrofisiologia por décadas. Hoje, pipetas, tais são feitas de vidro capilares usando um extrator programável. Calor tais instrumentos do capilar usando um filamento de metal ou de um laser e tirar o vidro usando a gravidade, um motor ou ambos. Pipetas para patch-clamp de gravação são formadas utilizando apenas o calor ea gravidade, enquanto eletrodos afiados para a gravação intracelular usar uma combinação de calor, gravidade, e um motor. O procedimento usado para fazer gravação de pipetas intracelular é semelhante ao usado para fazer agulhas de injeção para uma variedade de aplicações, incluindo cRNA injeção em oócitos Xenopus. Em vidro, em geral capilar <1,2 mm de diâmetro é usado para fazer pipetas para gravação de patch clamp, enquanto estreito de vidro é usado para a gravação intracelular (diâmetro externo = 1,0 mm). Para cada ferramenta, o extrator é programado de forma ligeiramente diferente. Este vídeo mostra como fazer os dois tipos de pipetas de gravação usando programas pré-estabelecidos extrator.

Protocolo

Pipetas puxando

Utilizando um extrator de microeletrodos como o Sutter P-97 Flaming / Brown, puxe um conjunto de aproximadamente 10-20 pipetas.

1. Selecione seu vidro capilar. Usamos borosilicato capilares (Sutter BF150-110-10, diâmetro externo 1,5 mm, diâmetro interno 1,1 milímetros, 10 centímetros de comprimento). Armazenar o vidro com cuidado para que ele permaneça limpo e livre de poeira.
2. Conceber um programa de puxar. Usamos um programa passo 5, com o calor descendente e velocidade a cada passo, e um pequeno empuxo na etapa final. Cookbook Sutter pipeta é uma excelente referência para o desenvolvimento de programas adequados.
3. Examine as pontas de pipeta sob um microscópio para determinar o diâmetro de abertura e suavidade. Descartar áspera, dicas irregular, ou irregular. Um bom protocolo puxando deve garantir estes são raros. Para a gravação de patch-clamp padrão, aberturas de ponta deve ser mícrons de diâmetro 1-3. A cônico (blunt ponta) leva a menor resistência para o diâmetro de abertura mesmo. Forma e tamanho pode ser modificado pelo polimento pressão.

Polimento pipetas fogo

1. Criar uma plataforma de polimento (microforge) com um filamento de platina de aquecimento controlado por um pedal. Um kit útil está disponível a partir ALA Científica (CPM-2) ou um aparelho semelhante pode ser montado aos poucos.
2. Opcional: Brasão da pipeta com um isolante para diminuir a capacitância e melhorar as características de ruído. Usamos cera dental. Sylgard 184 ™ (poli-dimetil elastômero de siloxano também conhecido como PDMS) também é uma opção.
3. Se usar a cera, mantenha um pequeno estoque de fundição nas proximidades. Com pressão de ar na parte traseira da pipeta para manter cera de entrar na pipeta, mergulhe a ponta brevemente para a cera líquida e remover. Com Sylgard, armazenar elastômero preparado congelado em alíquotas e pintar a ponta da pipeta sob um microscópio. Calor para a cura do elastômero.
4. Coloque a pipeta (revestidos ou não) no aparelho de polimento e trazer a ponta a 50 microns do filamento. Tenha em mente que o filamento se expande quando aquecida.
5. Recomendações: Siga o protocolo separado para "polir pressão" para alterar a forma da pipeta para ótima resistência e diâmetro da ponta.
6. Um pulso de calor breve (1-2 segundos) é suficiente para remover a cera da ponta da pipeta e suave do vidro.
7. Coloque a pipeta terminou em uma caixa fechada para proteger da poeira, repita por 10 pipetas de sucesso.

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Discussão

O protocolo aqui é ilustrado no uso diário em eletrofisiologia laboratórios e também é usado para fazer agulhas de injeção de células e animais. Com um extrator programáveis, é fácil de fazer pipetas para uma variedade de usos. Com atenção e cuidado, o filamento em seu puxador vai durar um ano ou mais. Boa sorte com suas experiências.

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Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Micropipette Puller	Instrument	Sutter Instrument Co.	P-97	Or similar instrument (e.g. Sutter P-87 or P-2000)
Glass Capillaries	Reagent	Sutter Instrument Co.	BF150-86-10	Or, similar capillary glass. To make filling the pipette easier, use a capillary with a glass filament.