O Modelo de encefalopatia hipóxico isquêmica Perinatal da Isquemia

Resumo

O modelo de ratos pós-natal para hipóxico-isquêmica lesão cerebral é um modelo bem estabelecido de humanos encefalopatia hipóxico isquêmica neonatal (HIE). Neste artigo, descrevemos o modelo de HIE em filhotes de ratos pós-natal.

Resumo

Encefalopatia hipóxico-isquêmica (EHI) é a conseqüência de asfixia sistêmica que ocorre no nascimento. Vinte e cinco por cento dos recém-nascidos com EHI desenvolver seqüelas graves e permanentes neuropsicológicos, incluindo retardo mental, paralisia cerebral e epilepsia. Os resultados da HIE são devastadores e permanentes, tornando-se fundamental para identificar e desenvolver estratégias terapêuticas para reduzir a lesão cerebral em recém-nascidos com EHI. Para o efeito, o modelo de rato neonatal para hipóxico-isquêmica lesão cerebral foi desenvolvido para este modelo condição humana. O modelo HIE foi validado por Vannucci et al ¹ e desde então tem sido amplamente utilizado para identificar mecanismos de lesão cerebral resultante da isquemia perinatal ^hypoxia-2 ​​e para testar potenciais intervenções terapêuticas ^3,4. O modelo HIE é um processo em duas etapas e envolve a ligadura da artéria carótida comum esquerda, seguida da exposição a um ambiente hipóxico. Fluxo sangüíneo cerebral (CBF) no hemisfério ipsilateral à artéria carótida ligada não diminui por causa do fluxo sanguíneo colateral através do polígono de Willis, no entanto com a tensão mais baixa de oxigênio, a CBF no hemisfério ipsilateral diminui significativamente e resulta em lesão isquêmica unilateral . O uso de cloreto de 2,3,5-trifeniltetrazólio (TTC) a mancha e identificar o tecido cerebral isquêmico foi originalmente desenvolvida para modelos adultos de isquemia cerebral de roedores ^5, e é usado para avaliar a extensão da infarctin cerebral em momentos iniciais até 72 horas após o evento isquêmico ^6. Neste vídeo, demonstramos o modelo de lesão hipóxico-isquêmica no cérebro de ratos pós-natal ea avaliação do tamanho do infarto usando coloração TTC.

Protocolo

Este protocolo foi aprovado pelo Institutional Animal Care e do Comitê Use na Universidade de Stanford e age de acordo com os Institutos Nacionais de Saúde diretrizes para o uso de animais experimentais.

Modelo de HIE neonatal Rat

1. Dia pós natal (PND) 7 filhotes de ratos Sprague-Dawley (Charles River Laboratories, Inc., Wilmington, MA) estão totalmente anestesiados com isoflurano (Aerrane, Baxter, Deerfield, IL; 3-4% para a indução e 1-2% para manutenção).
2. Uma pequena incisão é feita no pescoço (Extra Fino Tesoura Iris # 14088-10, Fine Ciência Tools Inc, Foster City, CA) para expor a artéria carótida comum esquerda (CCA).
3. O CCA é ligada com um fio de seda 5-0 (5-0 seda, Ethicon, Somer, NJ).
4. A incisão é fechada com cola de cianoacrilato (Elmers Products Inc, Columbus, OH). A incisão é coberta com fita adesiva e anestesia é interrompida. Os filhotes são devolvidos aos seus barragem e permitiu a recuperação de 1-2 horas.
5. Filhotes são então colocados em uma câmara hipóxica que contém oxigênio de 8% balanceada com nitrogênio 92% para 100 minutos a 37 ° C. 8% de gás nitrogênio oxygen/92% (Airgas, Sacramento, CA) do fluxo através de um tubo na gaiola do mouse equipado com uma cobertura de plástico. A capa é feita para se ajustar à gaiola e tem dois furos de 2 cm de diâmetro, um dos quais para receber o tubo ligado ao tanque de oxigênio de 8% do gás e outra permite que o gás flowout. A câmara é colocada em um banho de água e é aquecido antes do uso e um termômetro dentro dele deve registrar 37 ° C antes do início da hipóxia.
6. No final de 100 minutos de hipóxia, os filhotes são devolvidos de novo à sua barragem para a recuperação.
7. 24 horas após o fim da hipóxia, os filhotes são sacrificados por anestesia profunda com isoflurano. Tecido cerebral é perfundido com solução salina fria, seguido de uma solução de frio TTC 1% em tampão fosfato pH, solução salina 7,4 (Sigma Chemical Co, St Louis, MO). TTC devem ser mantidos ao abrigo da luz.
8. Cérebros são removidos e resfriados por 1-2 minutos no gelo, e quatro cortes coronais 3 milímetros de distância (níveis 1-4) são cortados, começando rostralmente ao nível do opticchiasm e infundíbulo, correspondente ao bregma 1,8 ~ 2,0 mm de nível o cérebro do rato adulto.
9. Fatias de cérebro são imersos numa solução TTC e incubados a 37 ° C por 8 minutos, seguido de fixação em paraformaldeído a 4% / PBS durante a noite. TTC porque é sensível à luz, manter fatias longe da luz durante este tempo.
10. Os cortes corados TTC são escaneados e digitalizados. Usando Image J (NIH, Bethesda, MD), os seguintes são medidos para cada nível: área de infarto (área imaculada), a área do hemisfério ipsilateral, ea área do hemisfério contralateral. O percentual de infarto área por fatia é calculado como: (área de infarto / área do hemisfério ipsilateral) ou A _1, A _2, A ₃ e A _4. Por cento do volume de infarto é calculada como a soma (A ₁ + A ₂ + A ₃ + A ₄₎ * 3mm. Áreas de lesão cortical ou estriado também pode ser quantificado separadamente de forma semelhante.

Resultados representante

Figura 1. HIE representativo níveis coronal 04/01 corados com TTC.

TTC manchada secções coronal demonstram área de infarto (em branco).

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Discussão

O roedor modelo HIE pós-natal é um modelo estabelecido que recapitula hipóxia cerebral que ocorrem no período peri-natal em recém-nascidos. Extensos estudos de caracterização histológica e imunocitoquímica têm demonstrado que o roedor 7 dias de idade tem a maturidade do cérebro análogo ao modelo um terceiro trimestre ⁷ feto humano. O modelo HIE roedor foi muito informativo para a compreensão dos mecanismos da lesão cerebral de peri-natal hipóxia ^2, onde as intervenções, tais como hipotermia foram valid...

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Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Sprague-Dawley Rat Pups	Animal	Charles River Laboratories
Isoflurane	Surgery	Baxter Internationl Inc.
8% Oxygen/ 92% Nitrogen Gas	Surgery	Airgas
2,3,5-triphenyl tetrazolium chloride	Reagent	Sigma-Aldrich	T8877
Phosphate buffered saline (PBS) pH 7.4	Reagent	GIBCO, by Life Technologies
Paraformaldehyde	Reagent	Sigma-Aldrich	P6148