1. Instalação e Preparação de Materiais

1. Obtenha um extrato lipídeco total (TLE) usando um método de extração de solvente (Sonication, Soxhlet ou Accelerated Solvent Extraction (ASE).
2. Prepare uma solução de 2 N KOH em 5% H₂O em metanol.
   1. KOH e metanol podem ser comprados em varejistas químicos. Esses produtos químicos devem ser puros e livres de hidrocarbonetos.
      1. A massa molar de KOH é ~56 amu rendendo 1 mol de OH^- para cada mol de KOH. Assim, para alcançar uma concentração de 2 N, dissolva 112 g de KOH em 0,95 L de água pura e 0,05 L de metanol.
      2. Note que a dissolução de KOH na água é exotérmica e cria uma grande quantidade de calor. Tome cuidado para adicionar as pelotas KOH à água lentamente para evitar uma reação violenta.
   2. Dissolva 112 g de pelotas KOH em 0,95 L de água pura em uma placa de agitação automática.
   3. Adicione 0,05 L de metanol uma vez que todo o KOH é dissolvido para ajudar na dissolução dos biomarcadores orgânicos na solução aquosa.
3. Prepare uma solução de ácido clorídrico de 6 N (HCl) em H₂O.
   1. HCl pode ser comprado de varejistas químicos. Este produto químico deve ser puro e livre de hidrocarbonetos.
   2. HCl geralmente vem concentrado como 13 N. Assim, uma mistura de 1:1 de HCl e água pura produz uma mistura de 6,5 N de HCl, que é perto o suficiente de 6 N para os propósitos deste experimento.
      1. Certifique-se de adicionar o HCL à água e não o contrário, pois adicionar água ao HCl concentrado é exotermímico e gera calor. Isso pode fazer com que o HCL espirre.
   3. Despeje suavemente e lentamente 100 mL HCl em um béquer contendo 100 mL de água pura, girando a mistura entre adições de HCl.
4. Prepare uma solução de 5% NaCl (sal de mesa) em H₂O.
   1. NaCl pode ser comprado de varejistas químicos. Este produto químico deve ser puro e livre de hidrocarbonetos.
   2. Calcular e pesar a massa de sal necessária para fazer ~1 L de solução de 5% (w/w). 1 L de água pesa ~1 kg ou 1.000 g. Assim, 50 g de NaCl dissolvido em 950 mL dá uma solução de 5% (50 g+ 950 g = 1.000 g; 50 g / 1.000 g = 0,05 ou 5%).
   3. Adicione suavemente 50 g de NaCl à água pura em uma placa de agitação automática e espere que ela se dissolva.
5. Obtenha os seguintes materiais: 2 frascos de vidro limpos e queimados (550 °C por 6 h) 40 mL borossilicados com tampa forrada com PTFE; um forno aquecido ou blocos de aquecimento; combustíveis (550 °C por 6 h) pipetas e lâmpadas de vidro borossilicato; fita pH (alcance ácido); Hexano (hexano pode ser comprado em varejistas químicos. Este produto químico deve ser Grau Optima ou equivalente).

2. Métodos

1. Comece com o TLE seco (contendo ésteres) em um dos frascos de vidro borossilicato de 40 mL.
2. Adicione aproximadamente 10 mL de 2 N KOH ao TLE e cap.
3. Aqueça no forno ou em um bloco de aquecimento a 60 °C por 2,5 h para apertar a ligação éster(Figura 3).
4. Remova a amostra do fogo e deixe esfriar até a temperatura ambiente.
5. Adicione aproximadamente 10 mL da solução NaCl de 5% à TLE (Figura 3). Isso ajuda a manter a interface entre a fase aquosa e orgânica (a ser adicionada) da espuma. Cap e shake brevemente.
6. Adicione 6 N HCl ao TLE salgado dropwise até que o pH 2 seja alcançado para protonar o O^- e formar o produto final, um ácido carboxílico estável(Figura 3; use papel pH para testar). Se o TLE foi colorido, pode haver uma mudança de cor coincidindo com pH 2.
7. Adicione aproximadamente 20 mL de hexano à solução acidificada, que agora está livre de éster. Cap e shake vigorosamente para 5 s para extrair compostos orgânicos da água.
8. Deixe definir até que as fases aquosas e orgânicas separem completamente. Sais, íons, água e HCl não redigido permanecem na fase aquosa. Compostos orgânicos estão agora no hexano.
9. Remova aproximadamente 75% do hexano supernante usando uma pipeta e dispense no outro frasco de vidro borossilicato de 40 mL.
10. Repita 2,7 - 2,9 duas vezes, adicionando aproximadamente 10 mL de hexano cada vez.
11. Descarte a mistura aquosa restante em um recipiente de resíduos adequado.
12. Rotule o frasco contendo hexano e orgânicos sem éster "TLE - saponificado.