Cultura de células As células podem ser cultivadas usando técnicas estabelecidas, mas devem ser semeadas em # 1 lamínulas de vidro revestidas com uma cola celulares (como polilisina, polyornithine ou laminina) para evitar que as células de separar ou em movimento durante as experiências de imagem. Soluções Experimentos com imagens de cálcio pode ser realizada utilizando uma variedade de soluções fisiológicas, incluindo meios de cultura celular. É importante, no entanto, para se certificar de que as soluções estão livres de vermelho de fenol, o que aumenta o fundo fluorescente. Usamos Tyrodes solução, que é feito facilmente e imita líquido cefalorraquidiano, e completá-la com 0,1% de soro albumina bovina. Usamos despolarização com 60-90 cloreto de potássio mM para ativar os canais de cálcio voltagem gated e tapsigargina 1 Hm (1 mM em DMSO estoque) ou 2μM Ionomicina (1 estoque mM em DMSO) para ativar loja operado canais CRAC. Muitas vezes é conveniente para remover o cálcio da solução extracelular para mostrar que elevações de cálcio são devido ao influxo de cálcio. Ao remover o cálcio é necessário para manter a concentração total de cátions divalentes (Mg 2 + e Ca 2 +) constante. Em caso de substituição de potássio de sódio é necessário para manter o equilíbrio osmótico. Tyrodes soluções: <table border="1"><tbody><tr><td></td><td> Baixa de potássio 2mM Ca 2 + Tyrodes (mM) </td><td> Baixa de potássio 0 Ca 2 + Tyrodes (mM) </td><td> Alta de potássio 2mM Ca 2 + Tyrodes (mM) </td><td> Alta de potássio 0 Ca 2 + Tyrodes (mM) </td></tr><tr><td> NaCl </td><td> 129 </td><td> 129 </td><td> 5 </td><td> 5 </td></tr><tr><td> KCl </td><td> 5 </td><td> 5 </td><td> 129 </td><td> 129 </td></tr><tr><td> CaCl2 </td><td> 2 </td><td> 0 </td><td> 2 </td><td> 0 </td></tr><tr><td> MgCl2 </td><td> 1 </td><td> 3 </td><td> 1 </td><td> 3 </td></tr><tr><td> Glicose </td><td> 30 </td><td> 30 </td><td> 30 </td><td> 30 </td></tr><tr><td> Hepes </td><td> 25 </td><td> 25 </td><td> 25 </td><td> 25 </td></tr></tbody></table> Ajustar o pH para 7,4 com NaOH Carregamento de Fura-2 corante de cálcio Nós carregamos células com acetoxi-metil-éster Fura-2 (Fura-2 AM), que se difunde através da membrana celular e é de-esterificados por esterases celulares para produzir Fura-2 ácido livre. Os parâmetros exatos para Fura-2 carga variam amplamente entre tipos de células. É aconselhável testar várias condições, preparando soluções de carregamento várias concentrações contendo um múltiplo de Fura-2 raging 1-4 M, incubando as células na solução de carga para uma variedade de tempos de 15 minutos a 2 horas e testar a carga à temperatura ambiente e a 37 graus. Um protocolo simplificado para neurônios corticais é dada abaixo: <ol><li> Primeiro, prepare a 1 mM Fura-02:00 estoque, adicionando 50μl de DMSO para um frasco de 50μg disponível a partir de Invitrogen. É importante o uso de DMSO secos embalados sob nitrogênio e é necessário remover o DMSO com uma agulha por punção do septo para impedir a hidratação do DMSO. Depois de preparar a solução de Fura-2 AM mantê-lo em um lugar escuro e seco. Fura-02:00 em DMSO é estável à temperatura ambiente por 24 horas e é estável a - 20 graus em um recipiente seco por vários meses. </li><li> Alíquota de 2 mls de meios de cultura para um tubo cônico de 15 ml, quente a 37 graus. e adicionar 2μl de Fura-02:00 ações para gerar um 1 Hm Fura-2:00 solução. Solução a Vortex vigorosamente durante 1 minuto. </li><li> Transferir a solução de carregamento para uma placa de cultura 35 milímetros de tecido e transferir a lamela com as células no prato. </li><li> Incubar os neurônios a 37 graus por 30 minutos em uma incubadora escuro. O tempo de incubação com precisão. </li><li> Prepare um prato de 35 mm contendo 2 ml de meio de cultura de tecido sem Fura-2 AM. Retirar as lamelas da solução de carga e coloque no prato novo. </li><li> Montar a lamínula na câmara de imagem. Retirar as lamelas do prato de 35 mm e rápida montagem para a câmara certificando-se de evitar o ressecamento das células. Nós usamos uma câmara de imagem fabricados pela Warner Instruments que permite uma lamela 10 milímetros contendo as células a ser montado na parte inferior e uma lamela segundo a ser montado na parte superior formando um sanduíche. As duas lamelas são garantidos com graxa de vácuo para a câmara e dois tubos em cada extremidade da câmara de permitir a perfusão de soluções através da câmara. A linha de entrada é conectado a uma seringa ea linha de saída é conectado a um bem que é esvaziado por uma linha de sucção conectado a uma armadilha de vácuo. </li></ol> O microscópio Nós usamos um microscópio invertido Nikon Eclipse TE2000-U equipada com um arco de xenon da lâmpada (Sutter Instruments), uma etapa automatizada (Ludl), uma roda de excitação do filtro (Ludl), e um dispositivo de carga par-cooled (CCD) da câmera (Hamamatsu Orka II). O microscópio é controlado por um com Macintoshputer executando o software Lab Open (Improvisação). Vários outros pacotes de software estão disponíveis para imagens raciométrica. Para geração de imagens que usamos 40, 60 ou 100x Nikon Fluor objetivos óleo de imersão com um NA superior a 1,2. Protocolo de imagem <ol><li> Calibrar o estágio do microscópio. </li><li> Carga Tyrodes solução para a linha de entrada tendo o cuidado de evitar a formação de bolhas de ar. </li><li> Ligue a câmara para as linhas de perfusão e solução Tyrodes perfundir através da câmara, mais uma vez, tomando o cuidado para evitar a formação de bolhas na câmara </li><li> Coloque uma gota de óleo sobre o objectivo, colocar a câmara sobre o estágio do microscópio e focar as células usando luz transmitida. </li><li> Examinar a fluorescência das células com uma iluminação a 340 e em 380 nm usando as oculares. Células em repouso deve ser fraca a 340 e brilhante a 380. Em geral, as células não deve ser iluminado com luz UV por mais de 10 ou 15 segundos ea intensidade da luz de excitação deve ser reduzida com um filtro de densidade neutra para evitar fototoxicidade. </li><li> Examine as células usando a câmera e definir o ganho ea exposição da câmera para gerar uma imagem que está próximo da saturação (mas não saturada) quando iluminados a 380 nm e bem abaixo da saturação quando iluminado a 340 nm. Manter a exposição abaixo de 200ms, se possível. Uma vez definida, não alteram o ganho da câmera ou a exposição a menos que você planeje também alterar o fundo, Rmin e Rmax (veja abaixo). </li><li> Coletar uma imagem em cada comprimento de onda e utilizar a ferramenta de região de interesse (ROI) para medir a intensidade do fundo em uma variedade de locais nas imagens para cada comprimento de onda. </li><li> A média dos valores de fundo e insira os valores de fundo para os locais apropriados no programa de imagem. O valor do fundo será subtraído de cada pixel no campo. </li><li> Coletar uma imagem de relação prática e ajustar os valores limite para cada comprimento de onda para gerar uma imagem de relação que inclui apenas as células e não o fundo e que não é ruidoso na região próxima às bordas das células. </li><li> Definir o valor de índice mínimo (Rmin) a ser cerca de 10% abaixo do menor proporção de qualquer célula no campo. </li><li> Definir o Rmax em cerca de 12 vezes a Rmin. Não altere a Rmin ou Rmax entre experimentos que pretende comparar como ele vai fazer a comparação difícil. Nós raramente mudar o Rmin e valores Rmax em nosso equipamento de imagem. </li><li> Use o palco automatizado para encontrar os campos que você planeja para a imagem, e registrar a localização de cada campo de utilização do software. Em geral, coletar cinco campos de visão durante um experimento. Os movimentos de palco automatizado para um campo, coleta uma imagem de relação e se move para o próximo campo. </li><li> Configure o intervalo de lapso de tempo para coletar imagens entre 0,1 e 10 segundos de diferença, dependendo do tipo de sinais que você espera ver. </li><li> Iniciar o experimento. </li><li> Ao testar o sistema de imagem de cálcio é frequentemente útil para usar estímulos como tyrodes elevado de potássio (65 mM KCl) ou ionomicina (2μM) que irá causar um aumento de cálcio intracelular e solução de cálcio livre extracelular que (contendo o buffers de cálcio como EGTA e BAPTA ) que irá reduzir a concentração de cálcio. </li></ol> Análise Uma vez que a experiência é completa você vai querer converter o conjunto de imagens de formato em medições de lapso de tempo de cálcio para as células individuais ou regiões de interesse dentro das células. Para fazer isso: <ol><li> Use a ferramenta região de interesse (ROI) para definir as áreas da imagem em que você quer medir cálcio. Em geral, é útil ter pelo menos um ROI que cobre o corpo da célula. Ao definir o ROI, é útil para reproduzir o filme das imagens para verificar se as células não se movem durante o curso do experimento. </li><li> Usar o software para coletar medições de lapso de tempo para cada relação de ROI em cada imagem. </li><li> Importar as medições relação em um programa de análise. Você vai precisar para ver os traços de cálcio para as células específicas ou ROIs, média ou várias células ROIs e converter as medidas relação a valores de cálcio intracelular. Nós usamos um conjunto de macros escritos em Igor Pro que nos permitem fazer todas essas tarefas de análise comum, mas outros programas como Excel, embora menos conveniente também pode ser usado. </li><li> A equação [Ca] = (RR min) / (R max-R) Sf * Kd pode ser usado para converter os valores Fura-2 a relação de concentrações de cálcio intracelular. [Ca] é a concentração de cálcio, R é o Fura-2 340/380 ratio, Rmin e Rmax estão as relações 340/380, na ausência de cálcio ou na presença de uma concentração de saturação de cálcio, respectivamente, e Sf * Kd é o produto do Kd de Fura-2 (aproximadamente 120 nm a RT) e um valor de escala. Para medir a R Min, Max e R Sf * Kd é necessário executar qualquer uma in vivo ou um na calibração in vitro. Na calibração vivo exige umcombinação de patch clamping e imagem de cálcio, que pode ser complicado, mas é também muito preciso. Na calibração in vitro pode ser feito usando um home-made câmara de calibração que consiste em duas lamelas separadas por um espaçador lamela fina para gerar uma fina camada de solução na qual para realizar a calibração. A maneira mais conveniente de medir valores Fura-2 proporção em função da concentração de cálcio é a utilização de um kit de calibração que contêm várias soluções de cálcio tamponado e Fura-2 ácido livre. Estes podem ser obtidos a partir Invitrogen (Molecular Probes) e contêm instruções precisas para o uso. </li></ol>

<ol>
	<li>Grynkiewicz, . <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+generation+of+Ca2++indicators+with+greatly+improved+fluorescence+properties.">A new generation of Ca2+ indicators with greatly improved fluorescence properties.</a> J. Biol. Chem. 260, 3440-3450 (1985).</li><li>Lewis, . <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitogen-induced+oscillations+of+cytosolic+Ca2++and+transmembrane+Ca2++current+in+human+leukemic+T+cells.">Mitogen-induced oscillations of cytosolic Ca2+ and transmembrane Ca2+ current in human leukemic T cells.</a> Cell Regul. 1, 99-112 (1989).</li><li>Dolmetsch, . <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Signaling+between+intracellular+Ca2++stores+and+depletion-activated+Ca2++channels+generates+[Ca2+]i+oscillations+in+T+lymphocytes.">Signaling between intracellular Ca2+ stores and depletion-activated Ca2+ channels generates [Ca2+]i oscillations in T lymphocytes.</a> J Gen Physiol. 103, 365-388 (1994).</li></ol>

Nesta apresentação nós passamos por todas as etapas para a realização de imagens de cálcio usando Fura-2 AM. Usamos neurônios corticais como um modelo, mas imagens de cálcio pode ser usado para medir a concentração de cálcio intracelular em tempo real em uma variedade de células. Ao fazer este procedimento é importante o uso de lamínulas de vidro em vez de plástico, uma vez que o plástico é muitas vezes fluorescentes em comprimentos de onda ultravioleta, o que torna difícil de imagem. Além disso, é importante para o reve...

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		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>New Item</td>
<td>Fura-2 AM</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>F1221</td>
<td>Protect from light</td>
</tr>
<tr>
<td>New Item</td>
<td>DMSO</td>
<td>EM Science</td>
<td>MX1457-6</td>
<td>Keep in dry place to prevent hydration</td>
</tr>
<tr>
<td>New Item</td>
<td>Albumin from bovine serum</td>
<td>Sigma</td>
<td>A8022-100G</td>
<td>Store at 4&#176;</td>
</tr>
<tr>
<td>New Item</td>
<td>Imaging Chamber</td>
<td>Warner Instruments</td>
<td>Model RC-20H</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>New Item</td>
<td>Microscope</td>
<td>Nikon</td>
<td>Eclipse TE2000-U</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>New Item</td>
<td>Potassium chloride</td>
<td>SIGMA</td>
<td>P9333-500G</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>New Item</td>
<td>Calibration Kit</td>
<td>Molecular Probes</td>
<td>F6774</td>
<td>Protect from light</td>
</tr>		</tbody>
		</table>
		</div>

calcium imaging of cortical neurons using fura-2 am

Imagem de cálcio é uma técnica comum, que é útil para medir sinais de cálcio em células em cultura. Técnicas de imagem de cálcio tirar proveito de corantes de cálcio indicador, que são baseados em BAPTA moléculas orgânicas que alterar as suas propriedades espectrais, em resposta à ligação de íons Ca2 +. Corantes indicador de cálcio caem em duas categorias, relação de métricas corantes como Fura-2 e Indo-1 e um único comprimento de onda corantes como Fluo-4. Relação de métricas corantes mudar tanto sua excitação ou seus espectros de emissão em resposta ao cálcio, permitindo a concentração de cálcio intracelular para ser determinada a partir da proporção de emissão de fluorescência ou excitação em comprimentos de onda distintos. A principal vantagem do uso de relação de métricas corantes mais sondas único comprimento de onda é que o sinal relação é independente da concentração de corante, a intensidade da iluminação, e comprimento do percurso óptico permitindo que a concentração de cálcio intracelular a ser determinada independentemente de esses artefatos. Um dos indicadores de cálcio mais comum é o Fura-2, que tem um pico de emissão em 505 nm e muda o seu pico de excitação de 340 nm até 380 nm, em resposta ao cálcio vinculativo. Aqui nós descrevemos o uso de Fura-2 para medir a elevação de cálcio intracelular em neurônios e outras células excitáveis.

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Calcium Imaging of Cortical Neurons using Fura-2 AM

Sinais de cálcio desempenham um papel fundamental em muitos processos celulares, incluindo a sobrevivência de expressão gênica e diferenciação. Aqui demonstramos como realizar imagens de cálcio usando Fura-2 AM. Imagem de cálcio é uma ferramenta valiosa para estudar a regulação do cálcio intracelular em tempo real e de sua regulamentação de cascatas de sinalização.

Imagem de cálcio dos neurônios corticais usando Fura-02:00

Calcium imaging is a common technique that is useful for measuring calcium signals in cultured cells. Calcium imaging techniques take advantage of calcium ...

calcium-imaging-of-cortical-neurons-using-fura-2-am

Research

JoVE Journal

Biology

60.6K visualizações.  Stanford University. Sinais de cálcio desempenham um papel fundamental em muitos processos celulares, incluindo a sobrevivência de expressão gênica e diferenciação. Aqui demonstramos como realizar imagens de cálcio usando Fura-2 AM. Imagem de cálcio é uma ferramenta valiosa para estudar a regulação do cálcio intracelular em tempo real e de sua regulamentação de cascatas de sinalização.

Vídeo: Calcium Imaging of Cortical Neurons using Fura-2 AM

Preparing E18 Cortical Rat Neurons for Compartmentalization in a Microfluidic Device

In this video, we demonstrate the preparation of E18 cortical rat neurons. E18 cortical rat neurons are obtained from E18 fetal rat cortex previously dissected and prepared. The E18 cortex is, upon dissection, immediately dissociated into individual neurons. It is possible to store E18 cortex in Hibernate E buffer containing B27 at 4&deg;C for up to a week before the dissociation is performed. However, there will be a drop in cell viability. Typically we obtain our E18 Cortex fresh. It is transported to the lab in ice cold Calcium free Magnesium free dissection buffer (CMFM). Upon arrival, trypsin is added to the cortex to a final concentration of 0.125%. The cortex is then incubated at 37&deg;C for 8 minutes. DMEM containing 10% FBS is added to the cortex to stop the reaction. The cortex is then centrifuged at 2500 rpm for 2 minutes. The supernatant is removed and 2 ml of Neural Basal Media (NBM) containing 2% B27 (vol/vol) and 0.25% Glutamax (vol/vol) is added to the cortex which is then re-suspended by pipetting up and down. Next, the cortex is triturated with previously fire polished glass pipettes, each with a successive smaller opening. After triturating, the cortex is once again centrifuged at 2500 rpm for 2 minutes. The supernatant is then removed and the cortex pellet re-suspended with 2 ml of NBM containing B27 and Glutamax. The cell suspension is then passed through a 40 um nylon cell strainer. Next the cells are counted. The neurons are now ready for loading into the neuron microfluidic device.

In this video we demonstrate the preparation of E18 Cortical Rat Neurons.

Preparando E18 neurônios de rato para Cortical Compartimentação em um dispositivo micro

In this video, we demonstrate the preparation of E18 cortical rat neurons. E18 cortical rat neurons are obtained from E18 fetal rat cortex previously ...

Biologia

In Vivo 2-Photon Calcium Imaging in Layer 2/3 of Mice

To understand network dynamics of microcircuits in the neocortex, it is essential to simultaneously record the activity of a large number of neurons . In-vivo two-photon calcium imaging is the only method that allows one to record the activity of a dense neuronal population with single-cell resolution . The method consists in implanting a cranial imaging window, injecting a fluorescent calcium indicator dye that can be taken up by large numbers of neurons and finally recording the activity of neurons with time lapse calcium imaging using an in-vivo two photon microscope. Co-injection of astrocyte-specific dyes allows one to differentiate neurons from astrocytes. The technique can be performed in mice expressing fluorescent molecules in specific subpopulations of neurons to better understand the network interactions of different groups of cells.

To understand network dynamics of microcircuits in the neocortex, it is essential to simultaneously record the activity of a large number of neurons . In-vivo two-photon calcium imaging is the only method that allows one to record the activity of a dense neuronal population with single-cell resolution .

Vivo em 2-Photon Imagens de cálcio na camada 2 / 3 dos Ratos

To understand network dynamics of microcircuits in the neocortex, it is essential to simultaneously record the activity of a large number of neurons .  ...

Live Imaging of Dense-core Vesicles in Primary Cultured Hippocampal Neurons

Observing and characterizing dynamic cellular processes can yield important information about cellular activity that cannot be gained from static images.  Vital fluorescent probes, particularly green fluorescent protein (GFP) have revolutionized cell biology stemming from the ability to label specific intracellular compartments and cellular structures. For example, the live imaging of GFP (and its spectral variants) chimeras have allowed for a dynamic 
analysis of the cytoskeleton, organelle transport, and membrane dynamics in a multitude of organisms and cell types [1-3].  Although live imaging has become prevalent, this approach still poses many technical challenges, particularly in primary cultured neurons.  One challenge is the expression of GFP-tagged proteins in post-mitotic neurons; the other is the ability to capture fluorescent images while minimizing phototoxicity, photobleaching, 
and maintaining general cell health.  Here we provide a protocol that describes a lipid-based transfection method that yields a relatively low transfection rate (~0.5%), however is ideal for the imaging of fully polarized neurons.  A low transfection rate is essential so that single axons and dendrites can be characterized as to their orientation to the cell body to confirm directionality of transport, i.e., anterograde v. retrograde.  Our approach to imaging 
GFP expressing neurons relies on a standard wide-field fluorescent microscope outfitted with a CCD camera, image capture software, and a heated imaging chamber. We have imaged a wide variety of organelles or structures, for example, dense-core vesicles, mitochondria, growth cones, and actin without any special optics or excitation requirements other than a fluorescent light source. Additionally, spectrally-distinct, fluorescently 
labeled proteins, e.g., GFP and dsRed-tagged proteins, can be visualized near simultaneously to characterize co-transport or other coordinated cellular events.  The imaging approach described here is flexible for a variety of imaging applications and can be adopted by a laboratory for relatively little cost provided a microscope is available.

Live cell imaging is of particular utility when studying the dynamics of organelle trafficking. Here we describe a protocol for live imaging of dense-core vesicles in cultured neurons using wide-field fluorescence microscopy. This protocol is flexible and can be adapted to image other organelles such as mitochondria, endosomes, and peroxisomes.

Imagens ao vivo de vesículas com núcleo denso na Primária Cultivadas neurônios do hipocampo

Observing and characterizing dynamic cellular processes can yield important information about cellular activity that cannot be gained from static images.  ...

In vivo Imaging of Deep Cortical Layers using a Microprism

We present a protocol for in vivo imaging of cortical tissue using a deep-brain imaging probe in the shape of a microprism.  Microprisms are 1-mm in size and have a reflective coating on the hypotenuse to allow internal reflection of excitation and emission light.  The microprism probe simultaneously images multiple cortical layers with a perspective typically seen only in slice preparations.  Images are collected with a large field-of-view (~900 &mu;m).  In addition, we provide details on the non-survival surgical procedure and microscope setup.  Representative results include images of layer V pyramidal neurons from Thy-1 YFP-H mice showing their apical dendrites extending through the superficial cortical layer and extending into tufts.  Resolution was sufficient to image dendritic spines near the soma of layer V neurons.  A tail-vein injection of fluorescent dye reveals the intricate network of blood vessels in the cortex.  Line-scanning of red blood cells (RBCs) flowing through the capillaries reveals RBC velocity and flux rates can be obtained. This novel microprism probe is an elegant, yet powerful new method of visualizing deep cellular structures and cortical function in vivo.

In vivo Imaging of Deep Cortical Layers using a Microprism

Right-angle microprisms inserted into the mouse neocortex allows for deep imaging of multiple cortical layers with a viewpoint typically found in slice. One-millimeter microprisms offer a wide field-of-view (~900 &mu;m) and spatial resolutions sufficient to resolve dendritic spines. We demonstrate layer V neuronal imaging and neocortical vascular imaging using microprisms.

Em Imaging vivo do Deep camadas corticais usando um Microprisma

We present a protocol for in vivo imaging of cortical tissue using a deep-brain imaging probe in the shape of a microprism.  Microprisms are 1-mm in size ...

Fluorescence-based Measurement of Store-operated Calcium Entry in Live Cells: from Cultured Cancer Cell to Skeletal Muscle Fiber

Store operated Ca2+ entry (SOCE), earlier termed capacitative Ca2+ entry, is a tightly regulated mechanism for influx of extracellular Ca2+ into cells to replenish depleted endoplasmic reticulum (ER) or sarcoplasmic reticulum (SR) Ca2+ stores1,2. Since Ca2+ is a ubiquitous second messenger, it is not surprising to see that SOCE plays important roles in a variety of cellular processes, including proliferation, apoptosis, gene transcription and motility. Due to its wide occurrence in nearly all cell types, including epithelial cells and skeletal muscles, this pathway has received great interest3,4. However, the heterogeneity of SOCE characteristics in different cell types and the physiological function are still not clear5-7.
The functional channel properties of SOCE can be revealed by patch-clamp studies, whereas a large body of knowledge about this pathway has been gained by fluorescence-based intracellular Ca2+ measurements because of its convenience and feasibility for high-throughput screening. The objective of this report is to summarize a few fluorescence-based methods to measure the activation of SOCE in monolayer cells, suspended cells and muscle fibers5,8-10. The most commonly used of these fluorescence methods is to directly monitor the dynamics of intracellular Ca2+ using the ratio of F340nm and F380nm (510 nm for emission wavelength) of the ratiometric Ca2+ indicator Fura-2. To isolate the activity of unidirectional SOCE from intracellular Ca2+ release and Ca2+ extrusion, a Mn2+ quenching assay is frequently used. Mn2+ is known to be able to permeate into cells via SOCE while it is impervious to the surface membrane extrusion processes or to ER uptake by Ca2+ pumps due to its very high affinity with Fura-2. As a result, the quenching of Fura-2 fluorescence induced by the entry of extracellular Mn2+ into the cells represents a measurement of activity of SOCE9. Ratiometric measurement and the Mn+2 quenching assays can be performed on a cuvette-based spectrofluorometer in a cell population mode or in a microscope-based system to visualize single cells. The advantage of single cell measurements is that individual cells subjected to gene manipulations can be selected using GFP or RFP reporters, allowing studies in genetically modified or mutated cells. The spatiotemporal characteristics of SOCE in structurally specialized skeletal muscle can be achieved in skinned muscle fibers by simultaneously monitoring the fluorescence of two low affinity Ca2+ indicators targeted to specific compartments of the muscle fiber, such as Fluo-5N in the SR and Rhod-5N in the transverse tubules9,11,12.

The extent of store-operated Ca2+ entry (SOCE) can be monitored using fluorescent Ca2+ indicators. Mn2+ quenching of such indicators assays SOCE in cultured cells and skeletal muscle fibers. A technique allowing spatial and temporal resolution of SOCE by confocal imaging of mechanically skinned muscle fibers is also described.

Fluorescência baseada em Medição da loja operada entrada de cálcio em células vivas: a partir de células cancerosas cultivadas em fibra muscular esquelética

Store operated Ca2+ entry (SOCE), earlier termed capacitative Ca2+ entry, is a tightly regulated mechanism for influx of extracellular Ca2+ into cells to ...

Direct Imaging of ER Calcium with Targeted-Esterase Induced Dye Loading (TED)

Visualization of calcium dynamics is important to understand the role of calcium in cell physiology. To examine calcium dynamics, synthetic fluorescent Ca2+ indictors have become popular. Here we demonstrate TED (= targeted-esterase induced dye loading), a method to improve the release of Ca2+ indicator dyes in the ER lumen of different cell types. To date, TED was used in cell lines, glial cells, and neurons in vitro. TED bases on efficient, recombinant targeting of a high carboxylesterase activity to the ER lumen using vector-constructs that express Carboxylesterases (CES). The latest TED vectors contain a core element of CES2 fused to a red fluorescent protein, thus enabling simultaneous two-color imaging. The dynamics of free calcium in the ER are imaged in one color, while the corresponding ER structure appears in red. At the beginning of the procedure, cells are transduced with a lentivirus. Subsequently, the infected cells are seeded on coverslips to finally enable live cell imaging. Then, living cells are incubated with the acetoxymethyl ester (AM-ester) form of low-affinity Ca2+ indicators, for instance Fluo5N-AM, Mag-Fluo4-AM, or Mag-Fura2-AM. The esterase activity in the ER cleaves off hydrophobic side chains from the AM form of the Ca2+ indicator and a hydrophilic fluorescent dye/Ca2+ complex is formed and trapped in the ER lumen. After dye loading, the cells are analyzed at an inverted confocal laser scanning microscope. Cells are continuously perfused with Ringer-like solutions and the ER calcium dynamics are directly visualized by time-lapse imaging. Calcium release from the ER is identified by a decrease in fluorescence intensity in regions of interest, whereas the refilling of the ER calcium store produces an increase in fluorescence intensity. Finally, the change in fluorescent intensity over time is determined by calculation of &Delta;F/F0.

Direct Imaging of ER Calcium with Targeted-Esterase Induced Dye Loading TED

Targeted-esterase induced dye loading (TED) supports the analysis of intracellular calcium store dynamics by fluorescence imaging. The method bases on targeting of a recombinant Carboxylesterase to the endoplasmic reticulum (ER), where it improves the local unmasking of synthetic low-affinity Ca2+ indicator dyes in the ER lumen.

Imagem direta de cálcio ER com Targeted-Esterase Induzida Dye Loading (TED)

Visualization of calcium dynamics is important to understand the role of calcium in cell physiology. To examine calcium dynamics, synthetic fluorescent ...

Measurement of Calcium Fluctuations Within the Sarcoplasmic Reticulum of Cultured Smooth Muscle Cells Using FRET-based Confocal Imaging

Maintenance of steady-state calcium (Ca2+) levels in the sarcoplasmic reticulum (SR) of vascular smooth muscle cells (VSMCs) is vital to their overall health. A significant portion of intracellular Ca2+ content is found within the SR stores in VSMCs. As the only intracellular organelle with a close association to the surrounding extracellular space through plasma membrane-SR junctions, the SR can be considered to constitute the first line of response to any irregularity in Ca2+ transients, or stress experienced by the cell. Among its many functions, one of the most important is its role in the transmission of Ca2+-regulated signals throughout the cell to induce further cell-wide reactions downstream. The more common use of cytoplasmic Ca2+ indicators in this regard is overall insufficient for research into the highly dynamic changes to the intraluminal SR Ca2+ store that have yet to be fully characterized. Here, we provide a detailed protocol for the direct and clear measurement of luminal SR Ca2+. This tool is useful for investigation into the nuanced changes in SR Ca2+ that have significant subsequent effects on the normal function and health of the cell. Fluctuations in SR Ca2+ content specifically can provide us with a significant amount of information pertaining to cellular responses to disease or stress conditions experienced by the cell. In this method, a modified version of a SR-targeted Ca2+ indicator, D1SR, is used to detect Ca2+ fluctuations in response to the introduction of agents to cultured rat aortic smooth muscle cells (SMCs). Following incubation with the D1SR indicator, confocal fluorescence microscopy and fluorescence resonance energy transfer (FRET)-based imaging are used to directly observe changes to intraluminal SR Ca2+ levels under control conditions and with the addition of agonist agents that function to induce intracellular Ca2+ movement.

Currently, most available calcium indicators are used to quantify cytoplasmic calcium transients as indirect measures of calcium released from the sarcoplasmic reticulum in cultured smooth muscle cells. This protocol describes the use of a specific FRET-based indicator that allows direct measurement of calcium signals within the sarcoplasmic reticulum lumen.

Medição das flutuações cálcio dentro do Sarcoplasmic retículo de células musculares lisas cultivadas utilizando FRET baseado em imagem confocal

Maintenance of steady-state calcium (Ca2+) levels in the sarcoplasmic reticulum (SR) of vascular smooth muscle cells (VSMCs) is vital to their overall ...

Concurrent EEG and Functional MRI Recording and Integration Analysis for Dynamic Cortical Activity Imaging

Electroencephalography (EEG) and functional magnetic resonance imaging (fMRI) are two of the fundamental noninvasive methods for identifying brain activity. Multimodal methods have sought to combine the high temporal resolution of EEG with the spatial precision of fMRI, but the complexity of this approach is currently in need of improvement. The protocol presented here describes the recently developed spatiotemporal fMRI-constrained EEG source imaging method, which seeks to rectify source biases and improve EEG-fMRI source localization through the dynamic recruitment of fMRI sub-regions. The process begins with the collection of multimodal data from concurrent EEG and fMRI scans, the generation of 3D cortical models, and independent EEG and fMRI processing. The processed fMRI activation maps are then split into multiple priors, according to their location and surrounding area. These are taken as priors in a two-level hierarchical Bayesian algorithm for EEG source localization. For each window of interest (defined by the operator), specific segments of the fMRI activation map will be identified as active to optimize a parameter known as model evidence. These will be used as soft constraints on the identified cortical activity, increasing the specificity of the multimodal imaging method by reducing cross-talk and avoiding erroneous activity in other conditionally active fMRI regions. The method generates cortical maps of activity and time-courses, which may be taken as final results, or used as a basis for further analyses (analyses of correlation, causation, etc.) While the method is somewhat limited by its modalities (it will not find EEG-invisible sources), it is broadly compatible with most major processing software, and is suitable for most neuroimaging studies.

An EEG-fMRI multimodal imaging method, known as the spatiotemporal fMRI-constrained EEG source imaging method, is described here. The presented method employs conditionally-active fMRI sub-maps, or priors, to guide EEG source localization in a manner that improves spatial specificity and limits erroneous results.

EEG simultâneo e gravação de ressonância funcional e análise de integração para a imagem latente de atividade Cortical dinâmica

Electroencephalography (EEG) and functional magnetic resonance imaging (fMRI) are two of the fundamental noninvasive methods for identifying brain ...

Analysis of Beta-cell Function Using Single-cell Resolution Calcium Imaging in Zebrafish Islets

Pancreatic beta-cells respond to increasing blood glucose concentrations by secreting the hormone insulin. The dysfunction of beta-cells leads to hyperglycemia and severe, life-threatening consequences. Understanding how the beta-cells operate under physiological conditions and what genetic and environmental factors might cause their dysfunction could lead to better treatment options for diabetic patients. The ability to measure calcium levels in beta-cells serves as an important indicator of beta-cell function, as the influx of calcium ions triggers insulin release. Here we describe a protocol for monitoring the glucose-stimulated calcium influx in zebrafish beta-cells by using GCaMP6s, a genetically encoded sensor of calcium. The method allows monitoring the intracellular calcium dynamics with single-cell resolution in ex vivo mounted islets. The glucose-responsiveness of beta-cells within the same islet can be captured simultaneously under different glucose concentrations, which suggests the presence of functional heterogeneity among zebrafish beta-cells. Furthermore, the technique provides high temporal and spatial resolution, which reveals the oscillatory nature of the calcium influx upon glucose stimulation. Our approach opens the doors to use the zebrafish as a model to investigate the contribution of genetic and environmental factors to beta-cell function and dysfunction.

Beta-cell functionality is important for blood-glucose homeostasis, which is evaluated at single-cell resolution using a genetically encoded reporter for calcium influx.

Análise da função de células Beta utilizando imagens de cálcio de célula única resolução em ilhotas de Zebrafish

Pancreatic beta-cells respond to increasing blood glucose concentrations by secreting the hormone insulin. The dysfunction of beta-cells leads to ...

Imaging Calcium Dynamics in Subpopulations of Mouse Pancreatic Islet Cells

Pancreatic islet hormones regulate blood glucose homeostasis. Changes in blood glucose induce oscillations of cytosolic calcium in pancreatic islet cells that trigger secretion of three main hormones: insulin (from &#946;-cells), glucagon (&#945;-cells) and somatostatin (&#948;-cells). &#946;-Cells, which make up the majority of islet cells and are electrically coupled to each other, respond to the glucose stimulus as one single entity. The excitability of the minor subpopulations, &#945;-cells and &#948;-cells (making up around 20% (30%) and 4% (10%) of the total rodent1 (human2) islet cell numbers, respectively) is less predictable and is therefore of special interest.
Calcium sensors are delivered into the peripheral layer of cells within the isolated islet. The islet or a group of islets is then immobilized and imaged using a fluorescence microscope. The choice of the imaging mode is between higher throughput (wide-field) and better spatial resolution (confocal). Conventionally, laser scanning confocal microscopy is used for imaging tissue, as it provides the best separation of the signal between the neighboring cells. A wide-field system can be utilized too, if the contaminating signal from the dominating population of &#946;-cells is minimized.
Once calcium dynamics in response to specific stimuli have been recorded, data are expressed in numerical form as fluorescence intensity vs. time, normalized to the initial fluorescence and baseline-corrected, to remove the effects linked to bleaching of the fluorophore. Changes in the spike frequency or partial area under the curve (pAUC) are computed vs. time, to quantify the observed effects. pAUC is more sensitive and quite robust whereas spiking frequency provides more information on the mechanism of calcium increase.
Minor cell subpopulations can be identified using functional responses to marker compounds, such as adrenaline and ghrelin, that induce changes in cytosolic calcium in a specific populations of islet cells.

Here, we present a protocol for imaging and quantifying calcium dynamics in heterogeneous cell populations, such as pancreatic islet cells. Fluorescent reporters are delivered into the peripheral layer of cells within the islet, which is then immobilized and imaged, and per-cell analysis of the dynamics of fluorescence intensity is performed.

Dinâmica de cálcio de imagem em subpopulações de células de ilhotas pancreáticas do rato

Pancreatic islet hormones regulate blood glucose homeostasis. Changes in blood glucose induce oscillations of cytosolic calcium in pancreatic islet cells ...