Agradecemos a Harald Hutter e Helena Decker para a sua leitura cuidadosa deste manuscrito. Agradecemos também Reg Sidhu da Leica Microsystems por sua perícia técnica. Esta pesquisa foi apoiada pelo Conselho Nacional e Ciências de Engenharia do Canadá, Prêmio # 327100-06, eo Simon Fraser University Faculty of Science.

Parte 1: Transfecção de neurônios utilizando Lipofectamine 2000 (Invitrogen) Equipamentos de set-up: Rato ou camundongo neurônios do hipocampo são cultivadas de acordo com Kaech e Banker, 2006 [4]. A densidade celular mais utilizados para a transfections é de 250.000 prato cells/6-cm. Reagentes e equipamentos necessários incluem 50 mM de ácido cinurênico, suporte para tubos regulares de bancada, um refrigerador de bancada (o melhor para manter frio reagente Lipofectamine), Reagente Lipofectamine, MEM, tubos de micropipetters e pinças esterilizadas. Procedimento: <ol><li> Para cada rótulo de transfecção dois tubos de 1,5 mL; um para conter o DNA plasmídeo, um para conter o reagente de transfecção. As incubações a seguir podem proceder à temperatura ambiente. <ol><li> Combine 1,0 mg de DNA plasmidial com 100 MEM mL em um tubo (sem suplementos de qualquer tipo; MEM não precisa ser temperatura de pH equilibrado). </li><li> Combine 6,0 Lipofectamine mL com 100 mL de MEM no tubo mL outros 1.5. <ol><li> Nenhum ajuste para transfections duplo são necessários embora o Lipofectamine: relação DNA serão reduzidos para metade em tais casos. A proporção de Lipofectamine: DNA ainda está dentro sugestão do fabricante. É melhor testar 0,5-1,0 mg para cada plasmídeo de expressão ideal. </li><li> Para preservar a vida de prateleira do reagente Lipofectamine, ele deve ser removido da geladeira por um tempo tão curto quanto possível e colocados em um resfriador de bancada, quando não em uso. Tempo total fora da geladeira deve ser mantida a um mínimo. </li></ol></li></ol></li><li> Incubar os tubos durante 5 minutos em temperatura ambiente. </li><li> Transferir a solução de DNA em MEM-no tubo de lipídios, e misture delicadamente com uma pipeta, em seguida, incubar por 30 minutos em temperatura ambiente. </li><li> Após 25 minutos, antes de lamínulas lançando, adicionar 60 mL de 50 mM de ácido cinurênico para minimizar os danos excitoxic para o prato de neurônios cultivados. <ol><li> Lamínulas cuidadosamente virar pé-side-up usando uma pinça estéril, e arranjar para que eles não se sobrepõem. Tenha cuidado para não raspar a superfície do neurônio revestido da lamela ou a superfície glia revestido do prato. </li></ol></li><li> Demorar cerca de 0,5 mL de meio do prato 6-cm e misture delicadamente com DNA no tubo, transferir a solução DNA de volta para o prato pingando uniformemente sobre a superfície do meio. </li><li> Não mexa, mas deslize prato e para trás em uma direção, então pare e repita na direção perpendicular para distribuir uniformemente os complexos DNA Lipofectamine. Incubar por 90 minutos na incubadora de cultura de tecidos (37 CO ° C, 5% 2). </li><li> Lamínulas virar pé-side-down, e arranjar para que eles não se sobrepõem. Permitir a expressão de prosseguir para o tempo desejado, geralmente durante a noite para 48 horas. </li></ol> Parte 2: imagens ao vivo de GFP-tagged vesículas com núcleo denso em cultura de neurônios do hipocampo Equipamentos de set-up: <ol><li> Imagens de células vivas requer um microscópio de fluorescência equipado com uma câmera CCD, nós usamos um microscópio Leica DMI 6000B invertido equipado com a variável Leica, lâmpada fluorescente. Também é necessário uma câmara de imagem com controlador de temperatura e um aquecedor objetivo. Usamos a Warner Instruments RC-21BR modificado para uma lamínula de 18 mm, além de um aquecedor plataforma (cat. # PH2) e controlador de temperatura (cat. # TC324B). A câmara contém nenhuma porta aberta, uma modificação que pode ser incluído na encomenda da câmara. Um aquecedor objetivo é altamente recomendado para ajudar a manter a temperatura da lamela e minimizar as alterações no foco devido a flutuações de temperatura. Imagens são adquiridas com um Hamamatsu Orca-ER usando Metamorph software (dispositivos Molecular), incluindo o modo de &#39;streaming&#39; de aquisição drop-in. Nota-Nós não usamos uma câmara climática que inclui o microscópio inteiro. Esta adição é caro e não é necessário para a imagem de curto prazo descrito aqui. </li><li> Outros equipamentos e reagentes incluem recém-preparada meio de imagem ao vivo (1X Hanks com Ca 2 + e Mg 2 + Glicose, 0,6%, e HEPES 10mM), adicionais lamínulas de vidro de 18 mm, pinças estéreis, não estéreis fórceps, Kimwipes, graxa de vácuo , e uma seringa (sem agulha ou com agulha modificada grande furo) com o qual se aplique graxa. </li></ol> Procedimento: <ol><li> Prepare meio de imagem fresca ao vivo (1X Hanks com Ca 2 + e Mg 2 + Glicose, 0,6%, e HEPES 10mM). Normalmente, prepare 50mls de cada vez e armazenar a 4 o C, quando não em uso. É melhor preparar o suficiente para não mais de uma semana de cada vez. ML aproximadamente 5-10 são usadas por prato de neurônios. </li><li> Iniciar microscópio, câmara, lâmpada fluorescente, e software de aquisição de imagem. Também ligar a energia para a plataforma de câmara e aquecedores objetivo. </li><li> Prepare a imaginarg câmara. <ol><li> A câmara inclui uma inserção Warner Teflon para a montagem de lamelas. Para maior facilidade de manipulação, com a etiqueta uma das inserir &quot;top&quot; com um marcador permanente. </li><li> Aplicar um anel de graxa ao sulco ao redor do buraco no lado da câmara de chamada &quot;top&quot;. Evitar o uso de excesso de como ele vai entrar na câmara e reduzir a área observável. </li><li> Utilizando uma pinça, coloque um pano limpo, lamela de 18 centímetros não utilizados para o lado &quot;top&quot; da câmara, aplique uma leve pressão para a lamela em suas bordas para criar um selo apertado dentro do sulco recesso da câmara. </li><li> Ligue a câmara e aplicar mais de um anel de graxa semelhante ao sulco no lado (inferior) em frente da câmara. </li><li> Coloque o lado da câmara bottom-up-preparada na tampa de um tubo de 50 mL, que é um suporte de câmara ideal. </li><li> Adicionar 750 mL de meio de imagens para a câmara. Esta é uma quantidade excessiva, mas a graxa deve evitar que o meio de derramar sobre o excesso e vai ajudar a prevenir bolhas de ser preso quando a lamela de células-coberto é aplicada. </li><li> Manter a câmara preparada na cultura de tecidos incubadora até que seja necessário. Incubações prolongadas, ~ 1 hora deve ser evitada, o meio de imagem irá evaporar e alteração da composição. </li></ol></li><li> Executar a montagem final e câmara de imagens de células vivas. <ol><li> Mover a câmara preparada e um prato de lamínulas transfectadas da incubadora para a capa de cultura de tecidos. </li><li> O conjunto de câmara final deve ser realizada rapidamente para garantir que as células permanecem imersos em médio e em 37 ° C continuamente. </li><li> Utilizando uma pinça estéril, remova cuidadosamente uma lamela do prato transfectadas, tocar na borda da lamínula para um Kimwipe para atraírem meio de crescimento. </li><li> Coloque a lamela neurônio-side-down para a câmara preparada. Toque um lado da lamela para a graxa primeiro e aplicar pressão ao redor das bordas para trazer a lamela plana, sem bolhas de interceptação. Meio de imagem em excesso derramará fora como esperado. </li><li> Limpe o excesso médio de imagem, mas tenha cuidado para não raspar as lamelas fora de posição. </li><li> Mover a câmara para o aquecedor plataforma pré-aquecido e fixar a câmara no lugar. </li><li> Transferência da câmara para o palco. </li><li> Para reduzir fotobranqueamento e photoxicity, ajustar a lâmpada para o valor mínimo de intensidade necessário encontrar células transfectadas. </li><li> Encontrar uma célula de interesse com um objetivo pequeno aumento de óleo (40X). É benéfico para furar a um padrão de pesquisa planejada para garantir a cobertura máxima e lamínula para evitar aquisições de imagens redundantes, à esquerda, por exemplo, topo de lamela, digitalização cima e para baixo trabalhando para a direita. </li><li> Mudar para um objetivo de ampliação elevada de óleo (60-100x), uma vez por campo desejado foi localizado. </li><li> Use &quot;aquisição stream&quot; ou função comparável de seu software de imagens para gravar um vídeo da dinâmica da proteína fluorescente-rotulados. </li><li> Dê uma imagem de fase e quaisquer outras imagens que acompanham (GFP Solúvel, por exemplo) para posterior análise e apresentação. </li><li> Salvar todas as imagens antes de explorar a lamela mais e gravar o vídeo a seguir. </li><li> Tipicamente 3-5 vídeos a partir de uma lamela é considerada bem sucedida. Fototoxicidade e saúde das células em geral deve ser mantido em mente que o transporte é reduzida em células danificadas. Saúde das células pode ser monitorada pela observação através de microscopia de fase. Tipicamente gravações são realizadas por cerca de 30 minutos por lamínula. </li></ol></li></ol> Parte 3: Resultados Representante: Observações imagens ao vivo de células tipicamente consistem de vídeos (também conhecido como &quot;pilhas&quot; de imagens) que mostram o movimento de organelas fluorescente marcadas dentro do campo de visão (Figura 1A). Que acompanham cada vídeo são muitas vezes apoiando as imagens que ilustram a orientação do campo de visão com relação ao nível de célula do corpo, de expressão de proteína e / ou a saúde da célula. Vídeos de transporte pode ser submetido a análise quantitativa por transformação para kymographs (Figura 1B). Kymographs são imagens que ilustram o movimento de partículas pela justaposição de scans linha onde cada momento é representado por uma coluna na quimógrafo. A Figura 2 demonstra como duas partículas que se movem em direção oposta são representados em um quimógrafo. Análise mais aprofundada das kymographs pode fornecer informações sobre fluxo de partículas, velocidade, tempo de execução, reversões, e partículas estacionárias. <img src="/files/ftp_upload/1144/fig1.jpg" alt="" /> Figura 1. Representante Observações Live Cell Imaging. (A) quadros selecionados de um vídeo de mCherry marcadas Plasminogênio Tecidual (TPA) de transporte. Partículas individuais se movendo na anterógrada (setas verdes) e retrógrado (setas vermelhas) direções são indicados. (B) Kymographs ilustrando movimento TPA-mCherry naaxônio. Linhas horizontais em kymographs representam objetos estacionários, enquanto as linhas diagonais representam organelas se afastando (inclinação positiva) ou para (inclinação negativa) o corpo da célula. As setas longo verde e vermelho mostram as corridas correspondentes às partículas em (A). Mudanças no transporte devido ao reagente de microtúbulos depolymerizing, Nocodazol, também é ilustrado com uma quimógrafo. Salientarmos a redução na organelas movendo pela ausência de linhas diagonais.

<ol>
	<li>Kulic, I. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+microtubule+movement+in+bidirectional+organelle+transport.">The role of microtubule movement in bidirectional organelle transport.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 105 (29), 10011-10016 (2008).</li><li>Jacobson, C., Schnapp, B., Banker, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+change+in+the+selective+translocation+of+the+Kinesin-1+motor+domain+marks+the+initial+specification+of+the+axon.">A change in the selective translocation of the Kinesin-1 motor domain marks the initial specification of the axon.</a> Neuron. 49 (6), 797-804 (2006).</li><li>Barkus, R. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+an+Axonal+Kinesin-3+Motor+for+Fast+Anterograde+Vesicle+Transport+that+Facilitates+Retrograde+Transport+of+Neuropeptides.">Identification of an Axonal Kinesin-3 Motor for Fast Anterograde Vesicle Transport that Facilitates Retrograde Transport of Neuropeptides.</a> Mol Biol Cell. 19 (1), 274-283 (2008).</li><li>Kaech, S., Banker, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Culturing+hippocampal+neurons.">Culturing hippocampal neurons.</a> Nat Protoc. 1 (5), 2406-2415 (2006).</li></ol>

Imagens de células vivas é uma técnica difícil, mas poderosa para a observação direta de organela transporte em neurônios cultivados. Podem surgir dificuldades com a montante do procedimento com pobre saúde neurônio devido a complicações cultura. Portanto, a saúde da célula (para exemplos, ver ref. 4) devem ser avaliadas antes e após a transfecção, observando as lamelas, enquanto em meio de crescimento usando um tecido microscópio de luz cultura. O processo de transferência dos neurônios contendo lam?...

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David M. Kwinter, Michael A. Silverman

instead of:

David Kwinter, Michael Silverman.

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Erratum: Live Imaging of Dense-core Vesicles in Primary Cultured Hippocampal Neurons.

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		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>MEM-Eagle with Earle salts and L-glutamine</td>
<td>Reagent</td>
<td>Mediatech</td>
<td>10-010-CV</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Lipofectamine 2000</td>
<td>Reagent</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>11668-027</td>
<td>Transfection reagent</td>
</tr>
<tr>
<td>10X Hanks with Ca2+ and Mg2+</td>
<td>Reagent</td>
<td>Gibco/Invitrogen</td>
<td>14185-052</td>
<td>Live-imaging medium</td>
</tr>
<tr>
<td>1M HEPES</td>
<td>Reagent</td>
<td>Gibco/Invitrogen</td>
<td>15630-130</td>
<td>Live-imaging medium</td>
</tr>		</tbody>
		</table>
		</div>

live imaging of dense-core vesicles in primary cultured hippocampal neurons

Observação e caracterização dinâmica processos celulares podem fornecer informações importantes sobre a atividade celular que não pode ser adquirida a partir de imagens estáticas. Vital sondas fluorescentes, particularmente proteína fluorescente verde (GFP) revolucionaram a biologia celular decorrentes da capacidade de rótulo específico compartimentos intracelular e estruturas celulares. Por exemplo, a imagem ao vivo da GFP (e suas variantes espectral) quimeras têm permitido uma análise dinâmica do citoesqueleto, transporte organela, ea dinâmica da membrana em uma infinidade de organismos e tipos celulares [1-3]. Apesar de imagens ao vivo tornou-se predominante, essa abordagem ainda apresenta muitos desafios técnicos, particularmente no ensino primário neurônios cultivados. Um desafio é a expressão de proteínas GFP na pós-mitóticas neurônios, o outro é a capacidade de capturar imagens fluorescentes, minimizando fototoxicidade, fotodegradação, e manter a saúde das células em geral. Aqui nós fornecemos um protocolo que descreve um método de transfecção lipídica baseado em que produz uma taxa de transfecção relativamente baixo (~ 0,5%), porém, é ideal para a imagem de neurônios totalmente polarizada. A taxa de transfecção baixo é essencial para que os axônios e dendritos só pode ser caracterizada como a sua orientação para o corpo celular para confirmar a direcionalidade de transporte, ou seja, v. anterógrada retrógrada. A nossa abordagem à imagem GFP expressar neurônios depende de um microscópio de campo amplo fluorescente padrão equipado com uma câmera CCD, software de captura de imagem, e uma câmara de imagem aquecida. Temos imaged uma grande variedade de organelas ou estruturas, por exemplo, com núcleo denso vesículas, mitocôndrias cones, crescimento e actina, sem qualquer ótica ou requisitos especiais de excitação que não seja uma fonte de luz fluorescente. Além disso, espectralmente distintas, as proteínas etiquetadas fluorescente, por exemplo, GFP e dsRed marcadas proteínas, podem ser visualizados simultaneamente perto de caracterizar co-transporte ou outros eventos coordenados celular. A abordagem de imagem aqui descrito é flexível para uma variedade de aplicações de imagem e pode ser adotado por um laboratório de custo relativamente pouco desde um microscópio está disponível.

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Live Imaging of Dense-core Vesicles in Primary Cultured Hippocampal Neurons

Imagens de células vivas é de utilidade particular quando se estuda a dinâmica do tráfico organela. Aqui nós descrevemos um protocolo para geração de imagens ao vivo de vesículas com núcleo denso em neurônios cultivados com grande campo de microscopia de fluorescência. Este protocolo é flexível e pode ser adaptado para outras organelas imagem, tais como mitocôndrias, endossomos, e peroxissomos.

Imagens ao vivo de vesículas com núcleo denso na Primária Cultivadas neurônios do hipocampo

Observing and characterizing dynamic cellular processes can yield important information about cellular activity that cannot be gained from static images.  ...

live-imaging-dense-core-vesicles-primary-cultured-hippocampal

Research

JoVE Journal

Biology

12.5K visualizações.  Simon Fraser University. Imagens de células vivas é de utilidade particular quando se estuda a dinâmica do tráfico organela. Aqui nós descrevemos um protocolo para geração de imagens ao vivo de vesículas com núcleo denso em neurônios cultivados com grande campo de microscopia de fluorescência. Este protocolo é flexível e pode ser adaptado para outras organelas imagem, tais como mitocôndrias, endossomos, e peroxissomos.

Vídeo: Live Imaging of Dense-core Vesicles in Primary Cultured Hippocampal Neurons

Gene-gun Transfection of Hippocampal Neurons

Gene-gun Transfection de neurônios do hipocampo

Biologia

Primary Culture of Hippocampal Neurons from P0 Newborn Rats

The physiological properties of hippocampal neurons are commonly investigated, especially because of the involvement of the hippocampus in learning and memory. Primary hippocampal cell culturing allows neuroscientists to examine the activity and properties of neurons at the individual cell and single synapse level. In this video, we will demonstrate how to isolate and grow primary hippocampal cells from newborn rats. The hippocampus may be isolated from each newborn animal in as short as 2 to 3 minutes, and the cultures can be maintained for up to two weeks. We will also briefly demonstrate how to use these hippocampal neurons for ratiometric calcium imaging. While this protocol describes the process for the hippocampus, with little to no modification, it can be applied to other regions of the brain.

The dissection and growth of cells from an individual brain area facilitates investigation of cellular and physiological parameters. We describe a method for primary cell culturing that produces neuron-enriched cultures in a serum-free environment.

Cultura primária de neurônios do hipocampo de ratos recém-nascidos P0

The physiological properties of hippocampal neurons are commonly investigated, especially because of the involvement of the hippocampus in learning and ...

Live Imaging of Cell Motility and Actin Cytoskeleton of Individual Neurons and Neural Crest Cells in Zebrafish Embryos

The zebrafish is an ideal model for imaging cell behaviors during development in vivo. Zebrafish embryos are externally fertilized and thus easily accessible at all stages of development. Moreover, their optical clarity allows high resolution imaging of cell and molecular dynamics in the natural environment of the intact embryo. We are using a live imaging approach to analyze cell behaviors during neural crest cell migration and the outgrowth and guidance of neuronal axons.
Live imaging is particularly useful for understanding mechanisms that regulate cell motility processes. To visualize details of cell motility, such as protrusive activity and molecular dynamics, it is advantageous to label individual cells. In zebrafish, plasmid DNA injection yields a transient mosaic expression pattern and offers distinct benefits over other cell labeling methods. For example, transgenic lines often label entire cell populations and thus may obscure visualization of the fine protrusions (or changes in molecular distribution) in a single cell. In addition, injection of DNA at the one-cell stage is less invasive and more precise than dye injections at later stages.
Here we describe a method for labeling individual developing neurons or neural crest cells and imaging their behavior in vivo. We inject plasmid DNA into 1-cell stage embryos, which results in mosaic transgene expression. The vectors contain cell-specific promoters that drive expression of a gene of interest in a subset of sensory neurons or neural crest cells. We provide examples of cells labeled with membrane targeted GFP or with a biosensor probe that allows visualization of F-actin in living cells1.
Erica Andersen, Namrata Asuri, and Matthew Clay contributed equally to this work.

This protocol describes imaging of individual neurons or neural crest cells in living zebrafish embryos. This method is used to examine cellular behaviors and actin localization using fluorescence confocal time-lapse microscopy.

Imagens ao vivo da motilidade celular e citoesqueleto de actina de neurônios individuais e células da crista neural em embriões Zebrafish

The zebrafish is an ideal model for imaging cell behaviors during development in vivo. Zebrafish embryos are externally fertilized and thus easily ...

Adenovirus-mediated Genetic Removal of Signaling Molecules in Cultured Primary Mouse Embryonic Fibroblasts

The ability to genetically remove specific components of various cell signalling cascades has been an integral tool in modern signal transduction analysis. One particular method to achieve this conditional deletion is via the use of the Cre-loxP system. This method involves flanking the gene of interest with loxP sites, which are specific recognition sequences for the Cre recombinase protein. Exposure of the so-called floxed (flanked by loxP site) DNA to this enzyme results in a Cre-mediated recombination event at the loxP sites, and subsequent excision of the intervening gene3. Several different methods exist to administer Cre recombinase to the site of interest. In this video, we demonstrate the use of an adenovirus containing the Cre recombinase gene to infect primary mouse embryonic fibroblasts (MEFs) obtained from embryos containing a floxed Rac1 allele1. Our rationale for selecting Rac1 MEFs for our experiments is that clear morphological changes can be seen upon deletion of Rac1, due to alterations in the actin cytoskeleton2,5. 72 hours following viral transduction and Cre expression, cells were stained using the actin dye phalloidin and imaged using confocal laser scanning microscopy. It was observed that MEFs which had been exposed to the adeno-Cre virus appeared contracted and elongated in morphology compared to uninfected cells, consistent with previous reports2,5. The adenovirus method of Cre recombinase delivery is advantageous as the adeno-Cre virus is easily available, and gene deletion via Cre in nearly 100% of the cells can be achieved with optimized adenoviral infection.

In this video we use an adenovirus carrying the Cre recombinase gene to infect primary mouse embryonic fibroblasts carrying a floxed Rac1 allele.

Adenovírus mediada por remoção genética das moléculas de sinalização em fibroblastos de rato cultivadas Primária embrionárias

The ability to genetically remove specific components of various cell signalling cascades has been an integral tool in modern signal transduction ...

Fluorescence-based Measurement of Store-operated Calcium Entry in Live Cells: from Cultured Cancer Cell to Skeletal Muscle Fiber

Store operated Ca2+ entry (SOCE), earlier termed capacitative Ca2+ entry, is a tightly regulated mechanism for influx of extracellular Ca2+ into cells to replenish depleted endoplasmic reticulum (ER) or sarcoplasmic reticulum (SR) Ca2+ stores1,2. Since Ca2+ is a ubiquitous second messenger, it is not surprising to see that SOCE plays important roles in a variety of cellular processes, including proliferation, apoptosis, gene transcription and motility. Due to its wide occurrence in nearly all cell types, including epithelial cells and skeletal muscles, this pathway has received great interest3,4. However, the heterogeneity of SOCE characteristics in different cell types and the physiological function are still not clear5-7.
The functional channel properties of SOCE can be revealed by patch-clamp studies, whereas a large body of knowledge about this pathway has been gained by fluorescence-based intracellular Ca2+ measurements because of its convenience and feasibility for high-throughput screening. The objective of this report is to summarize a few fluorescence-based methods to measure the activation of SOCE in monolayer cells, suspended cells and muscle fibers5,8-10. The most commonly used of these fluorescence methods is to directly monitor the dynamics of intracellular Ca2+ using the ratio of F340nm and F380nm (510 nm for emission wavelength) of the ratiometric Ca2+ indicator Fura-2. To isolate the activity of unidirectional SOCE from intracellular Ca2+ release and Ca2+ extrusion, a Mn2+ quenching assay is frequently used. Mn2+ is known to be able to permeate into cells via SOCE while it is impervious to the surface membrane extrusion processes or to ER uptake by Ca2+ pumps due to its very high affinity with Fura-2. As a result, the quenching of Fura-2 fluorescence induced by the entry of extracellular Mn2+ into the cells represents a measurement of activity of SOCE9. Ratiometric measurement and the Mn+2 quenching assays can be performed on a cuvette-based spectrofluorometer in a cell population mode or in a microscope-based system to visualize single cells. The advantage of single cell measurements is that individual cells subjected to gene manipulations can be selected using GFP or RFP reporters, allowing studies in genetically modified or mutated cells. The spatiotemporal characteristics of SOCE in structurally specialized skeletal muscle can be achieved in skinned muscle fibers by simultaneously monitoring the fluorescence of two low affinity Ca2+ indicators targeted to specific compartments of the muscle fiber, such as Fluo-5N in the SR and Rhod-5N in the transverse tubules9,11,12.

The extent of store-operated Ca2+ entry (SOCE) can be monitored using fluorescent Ca2+ indicators. Mn2+ quenching of such indicators assays SOCE in cultured cells and skeletal muscle fibers. A technique allowing spatial and temporal resolution of SOCE by confocal imaging of mechanically skinned muscle fibers is also described.

Fluorescência baseada em Medição da loja operada entrada de cálcio em células vivas: a partir de células cancerosas cultivadas em fibra muscular esquelética

Store operated Ca2+ entry (SOCE), earlier termed capacitative Ca2+ entry, is a tightly regulated mechanism for influx of extracellular Ca2+ into cells to ...

4D Imaging of Protein Aggregation in Live Cells

One of the key tasks of any living cell is maintaining the proper folding of newly synthesized proteins in the face of ever-changing environmental conditions and an intracellular environment that is tightly packed, sticky, and hazardous to protein stability1. The ability to dynamically balance protein production, folding and degradation demands highly-specialized quality control machinery, whose absolute necessity is observed best when it malfunctions. Diseases such as ALS, Alzheimer's, Parkinson's, and certain forms of Cystic Fibrosis have a direct link to protein folding quality control components2, and therefore future therapeutic development requires a basic understanding of underlying processes. Our experimental challenge is to understand how cells integrate damage signals and mount responses that are tailored to diverse circumstances.
The primary reason why protein misfolding represents an existential threat to the cell is the propensity of incorrectly folded proteins to aggregate, thus causing a global perturbation of the crowded and delicate intracellular folding environment1. The folding health, or "proteostasis," of the cellular proteome is maintained, even under the duress of aging, stress and oxidative damage, by the coordinated action of different mechanistic units in an elaborate quality control system3,4. A specialized machinery of molecular chaperones can bind non-native polypeptides and promote their folding into the native state1, target them for degradation by the ubiquitin-proteasome system5, or direct them to protective aggregation inclusions6-9.
In eukaryotes, the cytosolic aggregation quality control load is partitioned between two compartments8-10: the juxtanuclear quality control compartment (JUNQ) and the insoluble protein deposit (IPOD) (Figure 1 - model). Proteins that are ubiquitinated by the protein folding quality control machinery are delivered to the JUNQ, where they are processed for degradation by the proteasome. Misfolded proteins that are not ubiquitinated are diverted to the IPOD, where they are actively aggregated in a protective compartment.
Up until this point, the methodological paradigm of live-cell fluorescence microscopy has largely been to label proteins and track their locations in the cell at specific time-points and usually in two dimensions. As new technologies have begun to grant experimenters unprecedented access to the submicron scale in living cells, the dynamic architecture of the cytosol has come into view as a challenging new frontier for experimental characterization. We present a method for rapidly monitoring the 3D spatial distributions of multiple fluorescently labeled proteins in the yeast cytosol over time. 3D timelapse (4D imaging) is not merely a technical challenge; rather, it also facilitates a dramatic shift in the conceptual framework used to analyze cellular structure.
We utilize a cytosolic folding sensor protein in live yeast to visualize distinct fates for misfolded proteins in cellular aggregation quality control, using rapid 4D fluorescent imaging. The temperature sensitive mutant of the Ubc9 protein10-12 (Ubc9ts) is extremely effective both as a sensor of cellular proteostasis, and a physiological model for tracking aggregation quality control. As with most ts proteins, Ubc9ts is fully folded and functional at permissive temperatures due to active cellular chaperones. Above 30 &deg;C, or when the cell faces misfolding stress, Ubc9ts misfolds and follows the fate of a native globular protein that has been misfolded due to mutation, heat denaturation, or oxidative damage. By fusing it to GFP or other fluorophores, it can be tracked in 3D as it forms Stress Foci, or is directed to JUNQ or IPOD.

Cellular viability depends on timely and efficient management of protein misfolding. Here we describe a method for visualizing the different potential fates of a misfolded protein: refolding, degradation, or sequestration in inclusions. We demonstrate the use of a folding sensor, Ubc9ts, for monitoring proteostasis and aggregation quality control in live cells using 4D microscopy.

Formação de imagens 4D de agregação de proteínas em células vivas

One of the key tasks of any living cell is maintaining the proper folding of newly synthesized proteins in the face of ever-changing environmental ...

Live Imaging of Apoptotic Cell Clearance during Drosophila Embryogenesis

The proper elimination of unwanted or aberrant cells through apoptosis and subsequent phagocytosis (apoptotic cell clearance) is crucial for normal development in all metazoan organisms. Apoptotic cell clearance is a highly dynamic process intimately associated with cell death; unengulfed apoptotic cells are barely seen in vivo under normal conditions. In order to understand the different steps of apoptotic cell clearance and to compare 'professional' phagocytes - macrophages and dendritic cells to 'non-professional' - tissue-resident neighboring cells, in vivo live imaging of the process is extremely valuable. Here we describe a protocol for studying apoptotic cell clearance in live Drosophila embryos. To follow the dynamics of different steps in phagocytosis we use specific markers for apoptotic cells and phagocytes. In addition, we can monitor two phagocyte systems in parallel: 'professional' macrophages and 'semi-professional' glia in the developing central nervous system (CNS). The method described here employs the Drosophila embryo as an excellent model for real time studies of apoptotic cell clearance.

Live Imaging of Apoptotic Cell Clearance during Drosophila Embryogenesis

Here we describe an effective method for studying dynamics of apoptotic cell clearance in vivo. This method employs live Drosophila embryos as a powerful model for monitoring phagocytosis of apoptotic cells using specific labeling of apoptotic cells and phagocytes.

Imagens ao vivo de Apuramento celular por apoptose durante<em&gt; Drosophila</em&gt; Embriogênese

The  proper elimination of unwanted or aberrant cells through apoptosis and  subsequent phagocytosis (apoptotic cell clearance) is crucial for normal  ...

Organelle Transport in Cultured Drosophila Cells: S2 Cell Line and Primary Neurons.

Drosophila S2 cells plated on a coverslip in the presence of any actin-depolymerizing drug form long unbranched processes filled with uniformly polarized microtubules. Organelles move along these processes by microtubule motors. Easy maintenance, high sensitivity to RNAi-mediated protein knock-down and efficient procedure for creating stable cell lines make Drosophila S2 cells an ideal model system to study cargo transport by live imaging. The results obtained with S2 cells can be further applied to a more physiologically relevant system: axonal transport in primary neurons cultured from dissociated Drosophila embryos. Cultured neurons grow long neurites filled with bundled microtubules, very similar to S2 processes. Like in S2 cells, organelles in cultured neurons can be visualized by either organelle-specific fluorescent dyes or by using fluorescent organelle markers encoded by DNA injected into early embryos or expressed in transgenic flies. Therefore, organelle transport can be easily recorded in neurons cultured on glass coverslips using living imaging. Here we describe procedures for culturing and visualizing cargo transport in Drosophila S2 cells and primary neurons. We believe that these protocols make both systems accessible for labs studying cargo transport.

Organelle Transport in Cultured Drosophila Cells: S2 Cell Line and Primary Neurons.

Drosophila S2 cells and cultured neurons are great systems for imaging of motor-driven organelle transport in vivo. Here we describe detailed protocols for culturing both cell types, their imaging and analysis of transport.

Transporte Organelle em Cultivadas<em&gt; Drosophila</em&gt; Células: Linha celular S2 e primário neurônios.

Drosophila S2 cells plated on a coverslip in the presence of any actin-depolymerizing drug form long unbranched processes filled with uniformly polarized ...

Visualization of G3BP Stress Granules Dynamics in Live Primary Cells

SGs can be visualized in cells by immunostaining of specific protein components or polyA+ mRNAs. SGs are highly dynamic and the study of their assembly and fate is important to understand the cellular response to stress. The deficiency in key factors of SGs like G3BP (RasGAP SH3 domain Binding Protein) leads to developmental defects in mice&#160;and alterations of the Central Nervous System. To study the dynamics of SGs in cells from an organism, one can culture primary cells and follow the localization of a transfected tagged component of SGs. We describe time-lapse experiment to observe G3BP1-containing SGs in Mouse Embryonic Fibroblasts (MEFs). This technique can also be used to study G3BP-containing SGs in live neurons, which is crucial as it was recently shown that these SGs are formed at the onset of neurodegenerative diseases like Alzheimer&#39;s disease. This approach can be adapted to any other cellular body and granule protein component, and performed with transgenic animals, allowing the live study of granules dynamics for example in the absence of a specific factor of these granules.

Stress granules (SGs) are cytoplasmic RNA granules containing stalled ribonucleoprotein particles (RNPs), and important in cellular response to various stresses. Dynamics of SGs can be followed in live cells by visualizing the localization of a tagged component of SGs in transfected primary cells after stress.

Visualização de G3BP Estresse grânulos Dynamics em pilhas ao vivo

SGs can be visualized in cells by immunostaining of specific protein components or polyA+ mRNAs. SGs are highly dynamic and the study of their assembly ...

Live Cell Imaging of Primary Rat Neonatal Cardiomyocytes Following Adenoviral and Lentiviral Transduction Using Confocal Spinning Disk Microscopy

Primary rat neonatal cardiomyocytes are useful in basic in vitro cardiovascular research because they can be easily isolated in large numbers in a single procedure. Due to advances in microscope technology it is relatively easy to capture live cell images for the purpose of investigating cellular events in real time with minimal concern regarding phototoxicity to the cells. This protocol describes how to take live cell timelapse images of primary rat neonatal cardiomyocytes using a confocal spinning disk microscope following lentiviral and adenoviral transduction to modulate properties of the cell. The application of two different types of viruses makes it easier to achieve an appropriate transduction rate and expression levels for two different genes. Well focused live cell images can be obtained using the microscope&#8217;s autofocus system, which maintains stable focus for long time periods. Applying this method, the functions of exogenously engineered proteins expressed in cultured primary cells can be analyzed. Additionally, this system can be used to examine the functions of genes through the use of siRNAs as well as of chemical modulators.

This protocol describes a method of live cell imaging using primary rat neonatal cardiomyocytes following lentiviral and adenoviral transduction using confocal spinning disk microscopy. This enables detailed observations of cellular processes in living cardiomyocytes.

Imagens de células vivas de primários de ratos neonatos Cardiomyocytes Após Adenoviral e Transdução Lentivirus Usando confocal Spinning Disk Microscopia

Primary rat neonatal cardiomyocytes are useful in basic in vitro cardiovascular research because they can be easily isolated in large numbers in a single ...