Para o isolamento de criptas murinas do intestino delgado, use adequadamente lavados fragmentos de cinco milímetros por cinco milímetros do intestino delgado murino isolado. Incubar os pedaços em antibióticos PBS contendo EDTA de dois milimolares por 30 minutos em gelo sem agitar. Para facilitar a solidificação da matriz extracelular, ou MEC, incubar previamente uma placa de 24 poços em uma incubadora de cultura de tecidos de 37 graus Celsius.
Depois de aspirar a solução de EDTA dos fragmentos de tecido, adicione 25 mililitros de antibióticos PBS frescos e frios. Em seguida, agite o recipiente vigorosamente com a mão, 30 a 40 vezes. Filtre a suspensão uma vez através de um filtro de 70 mícrons.
Antes de passar para a próxima etapa, confirme a presença das criptas sob o microscópio. Em seguida, centrifugar a suspensão a 390 G e quatro graus Celsius por três minutos. Em seguida, ressuspenda a pastilha da cripta em 20 mililitros de DMEM contendo 2% de sorbitol, doravante denominado DMEM sorbitol.
Transfira 10 mililitros da suspensão da cripta para cada um dos dois novos tubos de 15 mililitros. Desta vez, centrifugar os dois tubos a uma velocidade mais baixa de 80 G por três minutos a quatro graus Celsius para separar as grandes massas celulares das células ou detritos. Aspirar o sobrenadante suavemente, deixando cerca de dois mililitros de sobrenadante em cada tubo.
Em seguida, adicione 10 mililitros de sorbitol DMEM a cada tubo. Centrifugar a suspensão novamente a 80 G e quatro graus Celsius por três minutos. Aspirar o sobrenadante como demonstrado anteriormente e adicionar 10 mililitros de sorbitol DMEM para ressuspensão.
Depois de aspirar o sobrenadante, adicione 10 mililitros de DMEM completo e ressuspenda o pellet pipetando para cima e para baixo. Deixe a suspensão descansar por um minuto para obter as criptas flutuantes de forma eficiente. Após um minuto, filtre a suspensão de ambos os tubos em um tubo fresco através de um filtro de células de 70 mícrons para purificar as criptas.
Para contar as criptas puras antes da semeadura, pinge gotículas de 25 microlitros em um prato de seis centímetros em três pontos. Conte o número de criptas ao microscópio com aumento de 4X e calcule a concentração de criptas por 25 microlitros. Em seguida, centrifugar todo o filtrado a 290 G por três minutos a quatro graus Celsius.
Para semeadura, suspender as criptas em ECM a uma concentração de 100 criptas por 40 microlitros de ECM. Pipetar para cima e para baixo cinco a 10 vezes suavemente evitando bolhas de ar para obter uma suspensão homogênea. Em seguida, semeie 40 microlitros da suspensão da cripta por poço na placa pré-aquecida de 24 poços.
Incubar a placa de 24 poços por 15 minutos a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono para a polimerização da MEC. Cobrir a MEC por poço com 500 microlitros de meio de cultura contendo fator de crescimento epidérmico de camundongo, R-Spondin 1 de camundongo recombinante e noggin de camundongo recombinante. A concentração final de materiais por poço é mostrada aqui.
Cultive as criptas incubando a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono. Realize imagens ao vivo para registrar a morfogênese organoide usando um microscópio de imagem Timelapse a cada três horas por até sete dias e obtenha imagens empilhadas Z seriais. Quase todas as criptas isoladas foram imediatamente seladas e apareceram em forma de cone uma vez espremidas para fora dos nichos epiteliais.
Além disso, as criptas na fração final foram integradas e adequadas para uso em cultura. Imagens em timelapse de crescimento organoide revelaram que a proliferação ativa e diferenciação de células-tronco intestinais ocorreram na região da cripta com brotamento. O brotamento foi acoplado à migração, proliferação e diferenciação celular de paneth.
