Comece preparando uma quantidade suficiente de mistura de eletroporação para o controle e gene de interesse. Conecte a câmara de eletrodos da placa de Petri ao eletroporador. Em seguida, usando as pontas do Microloader, preencha as agulhas de microinjeção com 8 microlitros de cada mistura de eletroporação.
Corte as pontas das agulhas antes de usar para obter um fluxo estável usando uma tesoura fina. Certifique-se de remover apenas uma pequena parte da ponta, pois uma ponta romba e larga pode danificar severamente os organoides. Ao microscópio, escolha cinco organoides cerebrais com bordas lisas e estruturas visíveis semelhantes a ventrículos.
Em seguida, mova-os para uma placa de cultura de células de 35 milímetros contendo DMEM/F-12 pré-aquecido usando uma ponta de pipeta cortada de 1000 microlitros. Agora, insira cuidadosamente a agulha através da parede de uma estrutura semelhante a um ventrículo e infunda-a com a mistura de eletroporação até ficar visivelmente preenchida. Não aplique pressão excessiva sobre estruturas semelhantes a ventrículos para evitar o rompimento.
Transferir um organoide cerebral microinjetado para a câmara do eletrodo da placa de Petri com uma pequena quantidade de DMEM/F-12. Dispor o organoide de modo que as superfícies das estruturas semelhantes a ventrículos microinjetados estejam voltadas para o eletrodo conectado ao polo positivo do eletroporador. Agora, eletroporar os organoides cerebrais um a um usando cinco pulsos de 80 volts por 50 milissegundos cada com um intervalo de um segundo.
Se a microinjeção e a eletroporação foram realizadas em condições não estéreis, mova os organoides eletroporados sob uma capela de fluxo laminar para uma nova placa de cultura de células de 35 milímetros preenchida com DMEM/F-12 pré-aquecido. Em seguida, cultivar os organoides eletroporados em DM com vitamina A em um agitador orbital a 55 RPM em uma atmosfera umedecida de 5% de dióxido de carbono e 95% de ar a 37 graus Celsius. No dia seguinte, após a eletroporação, verifique o sucesso da eletroporação nos organoides cerebrais em microscópio convencional de fluorescência invertida.
Transfira os organoides eletroporados para um tubo de centrífuga cônica de 15 mililitros usando uma ponta de pipeta cortada de 1000 microlitros e remova o excesso de meio. Adicionar uma quantidade suficiente de paraformaldeído a 4% em DPBS e incubar durante 30 minutos à temperatura ambiente. Ao final da incubação, aspirar o paraformaldeído.
Em seguida, adicione 5 mililitros de DPBS, agite suavemente e aspirar o DPBS. Armazenar os organoides em DPBS a 4 graus Celsius até uso posterior. Dois dias após a eletroporação, as células positivas para GFP estão quase exclusivamente localizadas na zona ventricular e são positivas para Pax6, indicando que essas células são progenitores apicais ou progenitores basais recém-nascidos.
Após 10 dias, as células positivas para GFP estão localizadas nas regiões basais. Essas células também são positivas para Pax6 ou NeuN, o que é indicativo de progenitores basais ou neurônios, respectivamente. A reconstrução 3-D dos organoides cerebrais eletroporados para obter uma impressão da distribuição 3-D das células GFP-positivas é mostrada.
