O método apresentado neste artigo surgiu de trabalho financiado pelo BBSRC BB / I021507 / 1 (TB, RJTW) e uma bolsa de estudo de doutorado MRC (MH).

Nota: Todas as experiências foram realizadas com acordo de Kings College London, Reino Unido e as orientações de cuidados de animais UK Home Office. 1. Dissecção da e14 Cerebelo <ol><li> Incubar ovos de galinha fertilizados marrom a 38 ° C para o dia 14 embrionário. </li><li> Usando uma tesoura de ovos decapitam embrião de galinha in ovo e remover a cabeça para uma placa de Petri contendo PBS gelado (Figura 1A). </li><li> Utilizando uma pinça standard, fazer incisões atrás de cada olho todo o caminho através do tecido, remover os olhos e maxilar superior. Adicione uma segunda incisão todo o caminho através da faringe remoção do maxilar inferior (Figura 1B). </li><li> Utilizando uma pinça padrão, retire toda a pele da superfície do crânio por descascar-lo fora (Figura 1C) e remover os ossos frontal e parietal, revelando cérebro. </li><li> De um aspecto ventral, remover cartilagem faríngea e mesenchyme auxiliar. </li><li> De um aspecto dorsal, cuidadosaly remover mesênquima dorsal para o hindbrain tomando cuidado para não danificar pia, eo cérebro inteiro em separado (Figura 1D). </li><li> Faça incisão todo o caminho através do tecido entre mesencéfalo e rombencéfalo e hindbrain separada, incluindo cerebelo (Figura 1E). </li><li> Ao fazer incisões todo o caminho através do tecido em ambas as junções laterais do cerebelo e placa alar do cérebro posterior, retire cerebelo inteiro, tendo o cuidado de manter a integridade da pia em todo dissecção (Figura 1F). Remover o plexo coróide de conformação (Figura 1G). </li><li> Mova o cerebelo dissecados em gelo frio HBSS. </li></ol> 2. Fatia Cultura da e14 Cerebelo <ol><li> Transferir todo o cerebelo para a plataforma de um tecido estéril Chopper utilizando uma espátula ou uma pipeta de Pasteur de 3 ml com a ponta cortada para alargar a abertura. Remover o excesso de líquido, utilizando uma pipeta. </li><li> Cortar em todo o cerebelo inteiro tele necessária orientação em 300 uM de espessura usando o cortador de tecido fixado com uma velocidade de corte de 50% do máximo. Integridade do tecido é mais facilmente preservados em corte sagital; No entanto, a orientação é também uma consideração importante para a análise de células (células de Purkinje são dendritos sagital alinhados, enquanto axónios de células granulares correr de forma transversal, perpendicular ao plano de dendrites de Purkinje). </li><li> Usando um 3 ml Pasteur pipeta, cobrir o cerebelo cortado no gelo frio HBSS. </li><li> Transfira as fatias em HBSS para um prato de 60 milímetros Petri contendo gelo fresco frio HBSS com uma pipeta Pasteur 3 ml com ponta de corte. </li><li> Sob um microscópio de dissecação iluminado com uma fonte de luz de fibra óptica, garantir a separação de fatias individuais usando uma pinça relojoeiro. Identificar fatias para ser electroporado, com base na sua integridade do tecido ea posição medio-lateral. Nota: Cada dissecação de embriões através de cortar incubação em meio de cultura leva cerca de 10-20 minutos, dependendo upon experiência. Realizar dissecções um de cada vez para assegurar que cerebelos passar quantidade mínima de tempo entre a decapitação e cultura ex vivo. </li></ol> 3. Eletroporação de Slices <ol><li> Construir uma câmara de electroporação, pela fixação do ânodo de um electroporador à base de uma placa de Petri 60 mm, com fita de isolamento. Adicionar cerca de 1 ml de HBSS a cobrir o eléctrodo. </li><li> Coloque uma inserção de cultura de 0,4 um no topo do eléctrodo coberto em HBSS. Permitir a inserção de cultura para descansar no eletrodo ter certeza que não é sempre contato entre a pastilha eo eletrodo. Nota: Nesta configuração, a inserção de cultura com as fatias repousará sobre a superfície da solução, mantendo-se o circuito, mas permitindo a selecção especial do cátodo. </li><li> Transferência de fatias identificadas (até cinco por inserção de cultura) na inserção de cultura utilizando 3 ml pipeta Pasteur com a ponta cortada. Separado e deixa-se repousar para inserção da cultura em um sagittorientação ai. </li><li> Usando uma pipeta, remover o excesso de HBSS a fim de que as fatias não são banhadas em solução. </li><li> Utilizando uma ponta de pipeta P10, ADN pipeta (a uma concentração de 1 ug / uL), diluída com 20% de verde rápido através da superfície da região alvo de uma fatia. 20% verde rápido garante solução de ADN viscoso e evita proibitivamente grande dispersão de DNA. Adicionar cerca de 5 ul de ADN / rápido solução verde para cada fatia (Figura 2B). </li><li> Coloque o cátodo sobre o tecido alvo desejado e electroporate com 3 x 10 V, 10 pulsos mseg de duração. Evitar o contacto directo do cátodo com o tecido. Em vez disso, tomar vantagem da tensão superficial do líquido para manter a condutância (o cátodo colocar o mais próximo possível do tecido quanto possível, sem realmente tocar no tecido). </li><li> Repetir a entrega de ADN e electroporação que regiões múltiplas da EGL em cada fatia cerebelar indivíduo como desejado. </li><li> Após a conclusão da eletroporação, cultura transferência inseRT a 30 mm numa caixa de Petri. </li><li> Para cada cultura, adicionar 1 ml de meio de cultura pré-aquecido (Meio Basal de Eagle, 0,5% (w / v) de D - (+) - glucose, 1% de suplemento B27, 2 mM de L-glutamina, 100 U / ml de penicilina, 100 ug / ml de estreptomicina) por baixo da inserção de cultura de tal modo que a inserção de cultura está em contacto com o meio, mas não fatias são banhadas nele. </li><li> Incubar as culturas a 37 ° C / 6% de CO 2 durante 3 dias. Substituir todo o meio de cultura a cada 24 horas com meio fresco pré-aquecido. </li><li> Após a cultura, em cultura de fatias de fixar insere durante 1 hora em 4% de paraformaldeído (ou O / N a 4 ° C) em 30 de um novo prato mm sem meios de cultura. </li></ol> 4. Criação de Imagens de Cerebelar Slices <ol><li> Após a fixação, as fatias lavar 3 vezes durante 5 min em PBS. </li><li> Usando uma lâmina de barbear, dissecar cada fatia cerebelar electroporado e cultivados a partir da inserção de cultura, cortando ao redor da fatia e de retirar a fatia e região de inserção é respeitado. Faznão tente remover fatia a partir da superfície da lâmina de cultura. </li><li> Fatias de montagem em cerca de 1 ml de meio de montagem contendo DAPI (se desejado) sob uma lamela tomando cuidado para não introduzir bolhas e imagem usando microscopia confocal de varredura a laser. Nota: Os parâmetros de imagem podem variar de acordo com as construções eletroporados, e ao critério do utilizador individual. </li></ol>

The authors have nothing to disclose.

O protocolo aqui relatado descreve um método para a dissecação, electroporating e cultura de fatias de embrionário do dia 14 a partir do cerebelo de pinto. Este protocolo permite a segmentação de eletroporação para pequenas regiões focais do EGL, incluindo isolado direcionamento dos lóbulos do cerebelo individuais. Ele permite a análise genética e de imagem com uma resolução elevada e conveniência, e de baixo custo em comparação com técnicas estabelecidas em roedores 43-47. Essa análise nã...

O cerebelo fica no final anterior da parte posterior do cérebro e é responsável pela integração do processamento sensorial e motor no cérebro maduro, bem como regulando processos cognitivos superiores 1. Nos mamíferos e aves, que possui uma morfologia elaborada e é fortemente foliados, um produto de grande amplificação trânsito de progenitores durante o desenvolvimento, que produz mais de metade dos neurónios no cérebro adulto. O cerebelo tem sido um tema de estudo para os neurobiólogos durante séculos e na era molecular recebeu igualmente uma atenção significativa. Isto diz respeito não só à sua biologia inerentemente interessante, mas também ao fato de que ele é fortemente implicado na doença humana, incluindo doenças genéticas de desenvolvimento, como transtornos do espectro do autismo 2 e mais proeminente o câncer cerebelar, meduloblastoma 3, que é o cérebro pediátrico mais prevalente tumor. Importante, é um excelente sistema de modelo dentro which para estudar alocação destino e neurogênese durante o desenvolvimento cerebral 4. Nos últimos anos, foi também estabelecida como um sistema modelo para o estudo comparativo de desenvolvimento do cérebro, devido à grande diversidade de formas de cerebelo visto do outro lado da filogenia vertebrado 5-10. O cerebelo desenvolve a partir da metade dorsal da rhombomere 1 no cérebro posterior 11 e desenvolvente é composta de duas populações progenitoras primárias, o lábio rômbica e da zona ventricular. O lábio rhombic se estende em torno da região dorsal do neuroepitélio da hindbrain na fronteira com a placa de telhado. É o berço dos neurônios excitatórios glutamatérgicos do cerebelo 12-14. A zona ventricular dá origem a neurônios do cerebelo GABAérgicos inibitórios, o mais proeminente os neurônios de Purkinje grandes 14,15. Mais tarde, em desenvolvimento (de cerca dia embrionário 13,5 em rato; e6 em pinto 16), Progen glutamatergicitors migrar tangencialmente a partir do lábio rômbica e formar uma camada de células progenitoras pial: uma zona secundária chamada de progenitor a camada externa de grânulo (EGL). É esta camada que sofre a grande amplificação de trânsito que leva para o grande número de neurônios granulares encontrados no cérebro maduro. Proliferação na EGL tem sido ligada à localização sub-pial que resulta da migração tangencial do lábio rômbico 17, com o interruptor para sair do ciclo celular e diferenciação neuronal de células progenitoras estarem associados com a sua saída a partir da camada exterior EGL para o meio EGL 18. Migração tangencial extensivo de células granulares pós-mitóticas no eixo lateral-medial ocorre no médio e interno EGL 19, antes da migração radial final para a camada de grânulos interior do córtex cerebelar maduro. A migração de células a partir do lábio rômbico sobre a superfície do cerebelo é dependente da sinalização da CXCL12 Pia 20-22 </sup&gt; E células de grânulos de expressar o receptor CXCR4 CXCL12. Sua migração tangencial é, portanto, lembra a dos tangencialmente neocortical migrando populações interneurônio inibitórios 23-25. Curiosamente, elétrons estudos microscópicos 17 sugeriram que as células EGL com uma morfologia proliferativa manter contato pial, ligando o comportamento das células com capacidade proliferativa de uma forma que lembra os progenitores basais do córtex dos mamíferos 26. Isso se reflete na estratificação acima mencionado da EGL em três subcamadas que são definidas por ambientes extracelulares distintas e onde os precursores granulares têm expressão genética distinta assinaturas 18. A proliferação de células progenitoras no oEGL ocorre com uma distribuição normal de tamanhos de clones de tal modo que quando são individualmente progenitores geneticamente marcado no final do desenvolvimento embrionário no ratinho, o que dá origem a uma média de 250-500 g mediana pós-mitóticoneurônios ranule 27,28. Proliferação é dependente de sinalização mitogénica de SHH subjacente Purkinje neurônios 29-32. A capacidade de responder a Shh foi demonstrado ser totalmente dependente de célula expressão autónoma do factor de transcrição Atoh1, tanto in vitro e in vivo 33 34,35. Da mesma forma, sair do ciclo celular e diferenciação tem sido mostrado para ser dependentes da expressão do factor de transcrição a jusante NeuroD1 36, o qual é provável que um repressor directo da Atoh1 37. Apesar deste progresso, e avanço considerável em decifrar a base biológica do ciclo celular de células de saída 38-42, o mecanismo molecular fundamental (s) que estão subjacentes à decisão de sair do ciclo celular e para a transição de um progenitor para um neurónio de diferenciação, e a migração tangencial pós-mitótico associado na EGL interior, bem como o interruptor mais tardea migração radial, permanecem completamente compreendida. Isto é, em grande medida devido ao intractability experimental da EGL: é manifestação tardia, e difícil de atingir uma vez que geneticamente muitas das mesmas moléculas neurogénicos também são cruciais no início da vida de precursores de grânulos no lábio rômbico. Para superar este problema, vários autores desenvolveram in vivo e ex vivo, electroporação, como um método para direccionar o cerebelo pós-natal em roedores 43-48. Aqui, nós caminho o uso de electroporação em ex vivo para estudar o pintainho EGL, o que representa consideráveis ​​vantagens em termos de custo e comodidade. Nosso método de eletroporação e ex vivo cultura fatia de tecido cerebelar pintainho utiliza tecido dissecado a partir do dia embrionário 14 pintos no pico da proliferação EGL. Este método permite a segmentação genética da EGL independentemente do lábio rhombic e irá definir o cenário para a análise genética da transição do grânuloprogenitoras para neurónios de grânulos pós-mitótico no cerebelo.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="573">
	<tbody>
		<tr height="105">
			<td height="105" style="height:105px;width:216px;">McIlwain tissue chopper</td>
			<td style="width:71px;">Mickle Laboratory Engineering Ltd</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:167px;">Cut at 300&#956;m for best results.</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Basal Medium Eagle (Gibco)</td>
			<td style="width:71px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">41010-026</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">L-glutamine</td>
			<td style="width:71px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">G7513</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">penicillin/streptomycin</td>
			<td style="width:71px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">P4333</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">0.4&#956;m culture insert</td>
			<td style="width:71px;">Millipore</td>
			<td>PICM0RG50</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">TSS20 Ovodyne electroporator&#160;</td>
			<td style="width:71px;">Intracel</td>
			<td style="width:119px;">01-916-02</td>
			<td>Use 3x10v, 10ms pulses for electroporation.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

ex vivo culture of chick cerebellar slices and spatially targeted electroporation of granule cell precursors

A camada externa de grânulo cerebelar (EGL) é o local de maior amplificação de trânsito no cérebro em desenvolvimento, e um excelente modelo para estudar a proliferação e diferenciação neuronal. Além disso, as modificações evolutivas da sua capacidade proliferativa ter sido responsável pela dramática expansão do tamanho do cerebelo nas amniotes, tornando o cerebelo um excelente modelo para estudos evo-devo do cérebro dos vertebrados. As células constituintes da EGL, progenitores de grânulos de cerebelo, também representam um celular significativa de origem para meduloblastoma, o tumor neuronal pediátrica mais prevalente. A seguir à amplificação de trânsito, os precursores de grânulos migrar radialmente para dentro da camada granular interna do cerebelo, onde eles representam a maior população de neurónios no cérebro de mamíferos madura. Em pintainho, o pico de proliferação EGL ocorre no final da segunda semana de gestação. A fim de direccionar a modificação genética para esta camada emo pico de proliferação, temos desenvolvido um método para a manipulação genética ex vivo através de electroporação de fatias do cerebelo a partir do Dia 14 embriões de pintos embrionários. Este método recapitula vários aspectos importantes da in vivo de grânulos desenvolvimento neuronal e será útil para gerar uma compreensão completa da proliferação de células granulares do cerebelo e diferenciação, e, portanto, do desenvolvimento do cerebelo, e a evolução da doença.

Esta seção ilustra exemplos de resultados que podem ser obtidos utilizando eletroporação fatia e cultura de cerebelo de embrionário Dia 14 do pintinho. A dissecção do cerebelo é ilustrada na Figura 1 e a câmara de electroporação configuração é mostrado na Figura 2. Nós mostramos que é possível electroporate e com sucesso fatias de cerebelo de cultura, que retêm a sua estrutura e morfologias celulares <e...

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Ex Vivo Culture of Chick Cerebellar Slices and Spatially Targeted Electroporation of Granule Cell Precursors

A camada externa de grânulo cerebelar é o local da maior amplificação de trânsito no cérebro em desenvolvimento. Aqui, apresentamos um protocolo para direcionar modificação genética a esta camada no pico de proliferação utilizando ex eletroporação vivo e cultura de fatias de cerebelo a partir do dia 14 embriões de galinha embrionárias.

Ex Cultura Vivo de Pintainho Cerebelar Slices e voltadas para o espaço Eletroporação do grânulo precursores de células

The cerebellar external granule layer (EGL) is the site of the largest transit amplification in the developing brain, and an excellent model for studying ...

ex-vivo-culture-chick-cerebellar-slices-spatially-targeted

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Ex Vivo Culture of Chick Cerebellar Slices and Spatially Targeted Electroporation of Granule Cell Precursors

9.2K visualizações.  King's College London.  A camada externa de grânulo cerebelar é o local da maior amplificação de trânsito no cérebro em desenvolvimento. Aqui, apresentamos um protocolo para direcionar modificação genética a esta camada no pico de proliferação utilizando ex eletroporação vivo e cultura de fatias de cerebelo a partir do dia 14 embriões de galinha embrionárias. 

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Efficient Gene Transfer in Chick Retinas for Primary Cell Culture Studies: An Ex-ovo Electroporation Approach

The cone photoreceptor-enriched cultures derived from embryonic chick retinas have become an indispensable tool for researchers around the world studying the biology of retinal neurons, particularly photoreceptors. The applications of this system go beyond basic research, as they can easily be adapted to high throughput technologies for drug development. However, genetic manipulation of retinal photoreceptors in these cultures has proven to be very challenging, posing an important limitation to the usefulness of the system. We have recently developed and validated an ex&#160;ovo plasmid electroporation technique that increases the rate of transfection of retinal cells in these cultures by five-fold compared to other currently available protocols1. In this method embryonic chick eyes are enucleated at stage 27, the RPE is removed, and the retinal cup is placed in a plasmid-containing solution and electroporated using easily constructed custom-made electrodes. The retinas are then dissociated and cultured using standard procedures. This technique can be applied to overexpression studies as well as to the downregulation of gene expression, for example via the use of plasmid-driven RNAi technology, commonly achieving transgene expression in 25% of the photoreceptor population. The video format of the present publication will make this technology easily accessible to researchers in the field, enabling the study of gene function in primary retinal cultures. We have also included detailed explanations of the critical steps of this procedure for a successful outcome and reproducibility.

Efficient Gene Transfer in Chick Retinas for Primary Cell Culture Studies: An Ex-ovo Electroporation Approach

Embryonic chick retinal cell cultures constitute valuable tools for the study of photoreceptor biology. We have developed an efficient gene transfer technique based on ex&#160;ovo plasmid electroporation of the retinas prior to culture. This technique considerably increases transfection efficiencies over currently available protocols, making genetic manipulation feasible for this system.

Transferência de Gene eficiente em retinas pintainho para célula primária Estudos de Cultura: An<em&gt; Ex-ovo</em&gt; Eletroporação Approach

The cone photoreceptor-enriched cultures derived from embryonic chick retinas have become an indispensable tool for researchers around the world studying ...

Biologia do Desenvolvimento

Optimized Ex-ovo Culturing of Chick Embryos to Advanced Stages of Development

Research in anatomy, embryology, and developmental biology has largely relied on the use of model organisms. In order to study development in live embryos model organisms, such as the chicken, are often used. The chicken is an excellent model organism due to its low cost and minimal maintenance, however they present observational challenges because they are enclosed in an opaque eggshell. In order to properly view the embryo as it develops, the shell must be windowed or removed. Both windowing and ex ovo techniques have been developed to assist researchers in the study of embryonic development. However, each of the methods has limitations and challenges. Here, we present a simple, optimized ex ovo culture technique for chicken embryos that enables the observation of embryonic development from stage HH 19 into late stages of development (HH 40), when many organs have developed. This technique is easy to adopt in both undergraduate classes and more advanced research laboratories where embryo manipulations are conducted.

Optimized Ex-ovo Culturing of Chick Embryos to Advanced Stages of Development

Viewing and accessing the chicken embryo during development can be challenging. We have developed an ex ovo method that is simple, cost effective, and can easily be used in a classroom or research setting. This method provides access to the embryo into late stages of embryonic development (HH 40).

Otimizado<em&gt; Ex-ovo</em&gt; A cultura de Chick embriões para estágio avançado de desenvolvimento

Research in anatomy, embryology, and developmental biology has largely relied on the use of model organisms. In order to study development in live embryos ...

Ex Utero Electroporation and Organotypic Slice Culture of Mouse Hippocampal Tissue

Mouse genetics offers a powerful tool determining the role of specific genes during development. Analyzing the resulting phenotypes by immunohistochemical and molecular methods provides information of potential target genes and signaling pathways. To further elucidate specific regulatory mechanisms requires a system allowing the manipulation of only a small number of cells of a specific tissue by either overexpression, ablation or re-introduction of specific genes and follow their fate during development. To achieve this ex utero electroporation of hippocampal structures, especially the dentate gyrus, followed by organotypic slice culture provides such a tool. Using this system to generate mosaic deletions allows determining whether the gene of interest regulates cell-autonomously developmental processes like progenitor cell proliferation or neuronal differentiation. Furthermore it facilitates the rescue of phenotypes by re-introducing the deleted gene or its target genes. In contrast to in utero electroporation the ex utero approach improves the rate of successfully targeting deeper layers of the brain like the dentate gyrus. Overall ex utero electroporation and organotypic slice culture provide a potent tool to study regulatory mechanisms in a semi-native environment mirroring endogenous conditions.

Ex Utero Electroporation and Organotypic Slice Culture of Mouse Hippocampal Tissue

Here we present a protocol providing a tool to examine regulatory mechanisms of specific genes during hippocampal development. Employing ex utero electroporation and organotypic slice culture allows the up- and down-regulation of the expression of genes of interest in single cells and follow their fate during development.

Ex Utero Eletroporação e Organotípicas Cultura Slice of Mouse Hippocampal Tissue

Mouse genetics offers a powerful tool determining the role of specific genes during development. Analyzing the resulting phenotypes by immunohistochemical ...

Ex Vivo Culture of Pharyngeal Arches to Study Heart and Muscle Progenitors and Their Niche

The pharyngeal mesoderm of developing embryos contributes to broad regions of head and heart musculature. We have developed a novel method to study head and heart progenitor cell development with pharyngeal arches (also known as branchial arches) ex vivo. Using this method, we have recently described that the second pharyngeal arch contains self-renewing heart progenitors and serves as a microenvironment for expansion of the progenitors during mouse heart development. The progenitor cells remain undifferentiated and expansive inside the arch, but quickly become functional cardiomyocytes as they migrate out of the arch. We also reported that first pharyngeal arch contains muscle progenitors giving rise to myotubes after leaving the arch. Here, we demonstrate the procedure for the dissection and ex vivo culture of first and second pharyngeal arches from developing mouse embryos. The method enables one to study head and heart progenitor/muscle development, including cardiomyocyte and myotube formation in detail ex vivo.

Ex Vivo Culture of Pharyngeal Arches to Study Heart and Muscle Progenitors and Their Niche

Here, we present a protocol to culture pharyngeal arches to study the biology of heart and muscle progenitor cells and their microenvironment.

Ex Cultura Vivo de Pharyngeal Arcos para estudo do coração e do músculo Progenitores e seu nicho

The pharyngeal mesoderm of developing embryos contributes to broad regions of head and heart musculature. We have developed a novel method to study head ...

Forward Genetic Approach to Uncover Stress Resistance Genes in Mice &#8212; A High-throughput Screen in ES Cells

Phenotype-driven genetic screens in mice is a powerful technique to uncover gene functions, but are often hampered by extremely high costs, which severely limits its potential. We describe here the use of mouse embryonic stem (ES) cells as surrogate cells to screen for a phenotype of interest and subsequently introduce these cells into a host embryo to develop into a living mouse carrying the phenotype. This method provides (1) a cost effective, high-throughput platform for genetic screen in mammalian cells; (2) a rapid way to identify the mutated genes and verify causality; and (3) a short-cut to develop mouse mutants directly from these selected ES cells for whole animal studies. We demonstrated the use of paraquat (PQ) to select resistant mutants and identify mutations that confer oxidative stress resistance. Other stressors or cytotoxic compounds may also be used to screen for resistant mutants to uncover novel genetic determinants of a variety of cellular stress resistance.

Forward Genetic Approach to Uncover Stress Resistance Genes in Mice &amp;#8212; A High-throughput Screen in ES Cells

Stress resistance is one of the hallmarks for longevity and is known to be genetically governed. Here, we developed an unbiased high-throughput method to screen for mutations that confer stress resistance in ES cells with which to develop mouse models for longevity studies.

Abordagem genética para a frente para descobrir genes de resistência a estresse em ratos - Uma tela de alta capacidade em células ES

Phenotype-driven genetic screens in mice is a powerful technique to uncover gene functions, but are often hampered by extremely high costs, which severely ...

Epicardial Outgrowth Culture Assay and Ex Vivo Assessment of Epicardial-derived Cell Migration

A single layer of epicardial cells lines the heart, providing paracrine factors that stimulate cardiomyocyte proliferation and directly contributing cardiovascular progenitors during development and disease. While a number of factors have been implicated in epicardium-derived cell (EPDC) mobilization, the mechanisms governing their subsequent migration and differentiation are poorly understood. Here, we present in vitro and ex vivo strategies to study EPDC motility and differentiation. First, we describe a method of obtaining primary epicardial cells by outgrowth culture from the embryonic mouse heart. We also introduce a detailed protocol to assess three-dimensional migration of labeled EPDC in an organ culture system. We provide evidence using these techniques that genetic deletion of myocardin-related transcription factors in the epicardium attenuates EPDC migration. This approach serves as a platform to evaluate candidate modifiers of EPDC biology and could be used to develop genetic or chemical screens to identify novel regulators of EPDC mobilization that might be useful for cardiac repair.

Epicardial Outgrowth Culture Assay and Ex Vivo Assessment of Epicardial-derived Cell Migration

Here, we describe methods for isolating primary mouse epicardial cells by an outgrowth culture assay and assessing the functional migration of epicardial-derived cells (EPDC) using an ex vivo heart culture system. These protocols are suitable for identifying genetic and chemical modulators of epicardial epithelial-to-mesenchymal transition (EMT) and motility.

Epicárdio Conseqüência Cultura Ensaio e<em&gt; Ex Vivo</em&gt; Avaliação da migração celular Epicárdica derivado

A single layer of epicardial cells lines the heart, providing paracrine factors that stimulate cardiomyocyte proliferation and directly contributing ...

Clonal Analysis of Embryonic Hematopoietic Stem Cell Precursors Using Single Cell Index Sorting Combined with Endothelial Cell Niche Co-culture

The ability to study hematopoietic stem cell (HSC) genesis during embryonic development has been limited by the rarity of HSC precursors in the early embryo and the lack of assays that functionally identify the long-term multilineage engraftment potential of individual putative HSC precursors. Here, we describe methodology that enables the isolation and characterization of functionally validated HSC precursors at the single cell level. First, we utilize index sorting to catalog the precise phenotypic parameter of each individually sorted cell, using a combination of phenotypic markers to enrich for HSC precursors with additional markers for experimental analysis. Second, each index-sorted cell is co-cultured with vascular niche stroma from the aorta-gonad-mesonephros (AGM) region, which supports the maturation of non-engrafting HSC precursors to functional HSC with multilineage, long-term engraftment potential in transplantation assays. This methodology enables correlation of phenotypic properties of clonal hemogenic precursors with their functional engraftment potential or other properties such as transcriptional profile, providing a means for the detailed analysis of HSC precursor development at the single cell level.

Here we present methodology for the clonal analysis of hematopoietic stem cell precursors during murine embryonic development. We combine index sorting of single cells from the embryonic aorta-gonad-mesonephros region with endothelial cell co-culture and transplantation to characterize the phenotypic properties and engraftment potential of single hematopoietic precursors.

Análise clonal de precursores embrionárias células-tronco hematopoiéticas usando índice de célula única classificação combinada com células endoteliais nicho co-cultura

The ability to study hematopoietic stem cell (HSC) genesis during embryonic development has been limited by the rarity of HSC precursors in the early ...

CRISPR-mediated Loss of Function Analysis in Cerebellar Granule Cells Using In Utero Electroporation-based Gene Transfer

Brain malformation is often caused by genetic mutations. Deciphering the mutations in patient-derived tissues has identified potential causative factors of the diseases. To validate the contribution of a dysfunction of the mutated genes to disease development, the generation of animal models carrying the mutations is one obvious approach. While germline genetically engineered mouse models (GEMMs) are popular biological tools and exhibit reproducible results, it is restricted by time and costs. Meanwhile, non-germline GEMMs often enable exploring gene function in a more feasible manner. Since some brain diseases (e.g., brain tumors) appear to result from somatic but not germline mutations, non-germline chimeric mouse models, in which normal and abnormal cells coexist, could be helpful for disease-relevant analysis. In this study, we report a method for the induction of CRISPR-mediated somatic mutations in the cerebellum. Specifically, we utilized conditional knock-in mice, in which Cas9 and GFP are chronically activated by the CAG (CMV enhancer/chicken &#223;-actin) promoter after Cre-mediated recombination of the genome. The self-designed single-guide RNAs (sgRNAs) and the Cre recombinase sequence, both encoded in a single plasmid construct, were delivered into cerebellar stem/progenitor cells at an embryonic stage using in utero electroporation. Consequently, transfected cells and their daughter cells were labeled with green fluorescent protein (GFP), thus facilitating further phenotypic analyses. Hence, this method is not only showing electroporation-based gene delivery into embryonic cerebellar cells but also proposing a novel quantitative approach to assess CRISPR-mediated loss-of-function phenotypes.

CRISPR-mediated Loss of Function Analysis in Cerebellar Granule Cells Using In Utero Electroporation-based Gene Transfer

Conventional loss-of-function studies of genes using knockout animals have often been costly and time-consuming. Electroporation-based CRISPR-mediated somatic mutagenesis is a powerful tool to understand gene functions in vivo. Here, we report a method to analyze knockout phenotypes in proliferating cells of the cerebellum.

Mediada por CRISPR perda de função de análise no grânulo cerebelar células usando no Utero Electroporation Gene transferência baseada

Brain malformation is often caused by genetic mutations. Deciphering the mutations in patient-derived tissues has identified potential causative factors ...

Ex Vivo Perfusion of the Rodent Placenta

The placenta is a key organ during pregnancy that serves as a barrier to fetal xenobiotic exposure and mediates the exchange of nutrients for waste. An assay is described here to perfuse an isolated rat placenta and evaluate the maternal-to-fetal translocation of xenobiotics ex vivo. In addition, the evaluation of physiological processes such as fluid flow to the fetus and placental metabolism may be conducted with this methodology. This technique is suitable for evaluating maternal-to-fetal kinetics of pharmaceutical candidates or environmental contaminants. In contrast to current alternative approaches, this methodology allows the evaluation of the isolated maternal-fetal vasculature, with the systemic neural or immune involvement removed, allowing any observed changes in physiological function to be attributable to local factors within the isolated tissue.

Here is presented a protocol of ex vivo maternal-fetal vascular perfusion to enable the administration of a test article into maternal vasculature and to evaluate placental transfer of xenobiotic particles or pharmacological agents in addition to alterations in placental physiology.

Perfusão ex vivo da placenta de roedores

The placenta is a key organ during pregnancy that serves as a barrier to fetal xenobiotic exposure and mediates the exchange of nutrients for waste. An ...

Electroporation Method for In Vivo Delivery of Plasmid DNA in the Adult Zebrafish Telencephalon

Electroporation is a transfection method in which an electrical field is applied to cells to create temporary pores in a cell membrane and increase its permeability, thereby allowing different molecules to be introduced to the cell. In this paper, electroporation is used to introduce plasmids to ependymoglial cells, which line the ventricular zone of the adult zebrafish telencephalon. A fraction of these cells shows stem cell properties and generates new neurons in the zebrafish brain; therefore, studying their behavior is essential to determine their roles in neurogenesis and regeneration. The introduction of plasmids via electroporation enables long-term labeling and tracking of a single ependymoglial cell. Furthermore, plasmids such as Cre recombinase or Cas9 can be delivered to single ependymoglial cells, which enables gene recombination or gene editing and provides a unique opportunity to assess the cell&#8217;s autonomous gene function in a controlled, natural environment. Finally, this detailed, step-by-step electroporation protocol is used to obtain successful introduction of plasmids into a large number of single ependymoglial cells.

Presented here is an electroporation method for plasmid DNA delivery and ependymoglial cell labeling in the adult zebrafish telencephalon. This protocol is a quick and efficient method to visualize and trace individual ependymoglial cells and opens up new possibilities to apply electroporation to a broad range of genetic manipulations.

Método de Electroporation para in vivo entrega de DNA plasmídeo no adulto zebrafish Telencephalon

Electroporation is a transfection method in which an electrical field is applied to cells to create temporary pores in a cell membrane and increase its ...