Pegue um disco de safira tratado com HPF e FSF pré-preparado contendo células HeLa estáveis, lave-o com tampão PBS-A por cinco minutos e repita esse processo três vezes. Transfira os discos de safira para uma placa de cultura de 35 milímetros contendo um mililitro de tampão PBS-A à temperatura ambiente. Substitua o tampão PBS-A na placa de cultura por um mililitro de solução redutora e incube por uma hora à temperatura ambiente.
Prepare o precursor de ouro em um mililitro de solução redutora e misture imediatamente por vórtice. Adicionar 80 microlitros de D-Penicilamina 500 milimolares em água bidestilada à solução precursora de ouro. E imediatamente vórtice.
Substitua a solução no prato cultivado por um mililitro de solução precursora de ouro e incube por duas horas a quatro graus Celsius. Adicione 20 a 100 microlitros da solução de borohidreto de sódio recém-preparada à solução precursora de ouro, agite imediatamente para misturar bem e incube durante cinco minutos à temperatura ambiente. Substitua a solução por dois mililitros de tampão PBS-A para parar a reação.
Em seguida, prepare a mistura de resina epóxi de acordo com as instruções do fabricante, transfira os discos de safira para cápsulas de embutimento de fundo plano e infiltre com resina por pelo menos 30 minutos à temperatura ambiente. Polimerizar o espécime a 60 graus Celsius em um forno por pelo menos 18 horas. Prepare seções ultrafinas do espécime polimerizado aparando os blocos do espécime cuidadosamente usando uma navalha para expor os discos de safira.
Mergulhe as pontas do bloco com discos de safira em nitrogênio líquido por vários segundos e descongele a temperatura ambiente. Repita a ação de congelamento-descongelamento várias vezes para separar os discos dos blocos. A proteína EGFP-MTn-KDEL apareceu como nanopartículas de ouro de dois a cinco nanômetros distribuídas exclusivamente no lúmen periférico do RE e no espaço perinuclear do envelope nuclear.
A ultraestrutura bem preservada permitiu a identificação de uma única molécula de proteínas marcadas e facilitou a análise de interações de organelas, como interações mitocondriais de ER. Nanopartículas da proteína Ost4-EGFP-MTn delinearam a membrana de RE na membrana externa do envelope nuclear. Da mesma forma, as células que expressam Mito-acGFP-MTn exibiram marcação específica na matriz mitocondrial.