Ligue o microscópio confocal de varredura a laser e coloque a lâmina no suporte da lâmina. Para visualização e aquisição de imagens, selecione a objetiva de 20X. A partir do software confocal, selecione o modo de varredura sequencial para evitar crosstalk entre o BODIPY 493/503 e o DAPI.
Em seguida, excite a matriz BODIPY 493/503 usando a linha de laser de argônio de 488 nanômetros e a coloração DAPI usando a linha de laser de 405 nanômetros. Defina as faixas de emissão em 493 a 589 nanômetros para BODIPY e 410 a 464 nanômetros para DAPI. Em seguida, defina as configurações do microscópio ajustando os tamanhos dos quadros, a velocidade de varredura e a média, que inclui o número de duas vezes a profundidade de bits como 12 bits, a direção como bidirecional, o zoom digital da área de varredura menos um e o pinhole menos uma unidade de área.
Ajuste as configurações de ganho e ganho digital. Verifique se não há pixels saturados, conforme indicado pelo indicador de intervalo. Após identificar com precisão as gotículas lipídicas, adquira a imagem com os canais BODIPY e DAPI.
Para criar imagens de área ampla, mude para uma lente subjetiva de 10X. Em seguida, ative o modo de varredura de blocos e configure-o para gerar imagens em mosaico cinco por cinco. Para gerar visualizações 3D e ortogonais, aplique uma gota de óleo de imersão na parte superior do vidro da tampa e mude a lente objetiva para uma lente 40X.
Selecione o modo Z-stack. Ajuste o plano Z para definir a primeira e a última posições para captura de imagem, garantindo uma espessura de corte óptico de aproximadamente 0,5 mícrons para capturar todas as gotículas em foco. Selecione o módulo ortográfico e crie visualizações ortogonais.
Adquira imagens 3D selecionando o módulo 3D seguindo o modo de renderização de transparência. Após a aquisição da imagem, comece a processar e analisar imagens de plano único usando o CellProfiler. Carregue as imagens em formato TIF clicando no modo de imagens no canto superior esquerdo da interface CellProfiler.
Use o módulo de nomes e tipos para classificar entre imagens coradas por gotículas BODIPY e núcleos DAPI com base nos nomes dos arquivos. Para análise de gotículas lipídicas, utilizar apenas imagens coradas com BODIPY. Inicie a construção do pipeline clicando em ajustar módulos e selecione o módulo cor para cinza para converter as imagens em escala de cinza.
Em seguida, usando o módulo identificar objetos primários, defina gotículas lipídicas entre 6 a 300 pixels e um fator de correção de limiar de um para detectar gotículas lipídicas dentro das imagens em escala de cinza. Para medir a intensidade do pixel das gotículas lipídicas identificadas, adicione um módulo de intensidade do objeto de medida. Incorpore um módulo adicional de objetos de filtro para garantir que apenas os sinais mais fortes sejam quantificados, enquanto sinais menos intensos são excluídos da análise final de gotículas lipídicas.
Em seguida, para medir as gotículas lipídicas relacionadas aos dados de saída, adicione o módulo de forma de tamanho do objeto de medida. Em seguida, adicione um módulo de contornos de sobreposição para sobrepor a gota identificada na imagem original e, assim, garantir que a segmentação pareça precisa na imagem não processada também. Uma vez feito, adicione uma exportação para o módulo de planilha e clique no botão analisar imagens no canto inferior esquerdo.
Comparados ao controle, os animais alimentados com DH apresentaram um perfil dislipidêmico pronunciado e discreto aumento nos níveis circulantes de triglicérides. Imagens de área ampla revelaram aumento de gotículas lipídicas em todos os fígados de animais alimentados com HFD. A análise com CellProfiler revelou um aumento do número de gotículas lipídicas hepáticas, aumento da intensidade de fluorescência de BODIPY, razão de área de 360% e diâmetros maiores.
A distribuição de tamanho nos animais alimentados com HFD revelou um aumento nas gotículas lipídicas macrovesiculares hepáticas de mais de nove mícrons e uma redução nas microvesículas de menos de três mícrons.
