Comece adicionando 500 microlitros do tampão de lise ao pellet de célula A2780 obtido anteriormente e misture suavemente usando uma ponta de corte com um diâmetro mínimo de abertura de dois milímetros. Adicione 20 microgramas por mililitro de RNase recém-preparada e misture por inversão suave. Incube a 37 graus Celsius por 30 minutos.
Ao final da incubação, adicionar proteinase K a uma concentração final de 100 microgramas por mililitro e inverter suavemente 10 vezes. Incubar novamente a 55 graus Celsius por uma hora invertendo o tubo a cada 10 minutos. Pipetar 500 microlitros de fenol:clorofórmio:álcool isoamílico reagente para dentro do tubo e inverter suavemente o tubo cerca de 20 vezes.
Centrifugar a 9, 391 G durante 15 minutos à temperatura ambiente. Pipetar a camada viscosa aquosa superior para um novo tubo. Adicione um volume igual de clorofórmio e misture por inversão suave.
Depois de centrifugar o tubo uma vez, colete a camada aquosa. Adicionar uma quantidade adequada de cloreto de sódio cinco molares no tubo para aumentar a concentração em 0,2 moles. Adicione dois volumes de etanol 100% no tubo e inverta suavemente 20 vezes.
Centrifugar a 15, 871 G durante cinco minutos à temperatura ambiente. Após descartar o sobrenadante, adicionar 500 microlitros de etanol 70%. Centrifugar novamente na mesma condição e, em seguida, descartar o sobrenadante.
Depois que o pellet estiver seco ao ar, adicione 50 microlitros de água livre de nuclease estéril e deixe reidratar. Em seguida, misture o DNA por pipetagem usando a ponta de corte. Use espectrofotometria UV para medir a concentração de DNA.
Depois de digerir o DNA, separe-o usando 0,8% de agarose. Submergir o gel de agarose em solução de ácido clorídrico 0,25 molar por 10 minutos à temperatura ambiente com agitação suave. Em seguida, enxágue o gel duas vezes com água destilada.
Para desnaturar o DNA, submergir o gel em uma solução de hidróxido de sódio e cloreto de sódio. Em seguida, enxágue o gel duas vezes com água destilada. Para neutralizar o DNA demonstrado, submergir o gel em uma solução de ácido clorídrico 0,5 molar e cloreto de sódio três molares em pH sete.
O DNA genômico do extrator mostrou boa integridade, indicando seu uso para posterior processamento a jusante de fragmentos de restrição telomérica.
