Para realizar o Southern Blotting, comece cortando uma membrana de nylon em um segmento de 10 por 12 centímetros. Faça um entalhe na mesma posição que o gel. Ativar a membrana mergulhando-a em água destilada, seguida de tampão citrato de sódio 20X.
Coloque uma mecha de papel filtro em uma bandeja invertida dupla, ajuste de tal forma que as extremidades toquem a base da bandeja externa. Coloque o gel sobre o papel de filtro. Em seguida, coloque a membrana de nylon ativada sobre o gel, garantindo que os entalhes se sobreponham.
Remova quaisquer bolhas de ar com uma haste de vidro. Coloque uma pilha de dois centímetros de papel de filtro de celulose de 9,5 por 11,5 centímetros e outra pilha de seis centímetros de papel de filtro normal. Coloque um peso sobre a configuração para uma distribuição de peso igual.
Encha a bandeja externa com tampão citrato de sódio 20X e deixe-a durante a noite para uma transferência eficiente. Após a transferência sul, fixe o DNA transferido na membrana por reticulação UV em um transiluminador UV. Lave a membrana duas vezes com 25 mililitros de tampão citrato de sódio 2X.
Para realizar a hibridização, incubar a membrana em 10 mililitros do tampão pré-hibridização pré-aquecido. Agite suavemente a membrana manualmente em intervalos frequentes. Em seguida, incube o blot em 10 mililitros de tampão de hibridização a 42 graus Celsius por três horas com agitação suave.
Lave a mancha duas vezes em 25 mililitros de tampão rigoroso por 10 minutos à temperatura ambiente com agitação suave. Agora lave a mancha duas vezes em 25 mililitros de tampão rigoroso pré-aquecido a 50 graus Celsius por 15 minutos com agitação suave. Enxaguar com 15 mililitros de tampão de lavagem por cinco minutos com agitação suave à temperatura ambiente.
Incubar a membrana em 10 mililitros de solução de bloqueio recém-preparada por 30 minutos à temperatura ambiente com agitação suave. Em seguida, coloque-o em 10 mililitros de antidigoxigenina conjugada com uma solução de trabalho de fosfatase alcalina. Lave a mancha duas vezes no tampão de lavagem à temperatura ambiente durante 15 minutos.
Agora incube em 10 mililitros de tampão de detecção por cinco minutos à temperatura ambiente. Depois de remover o excesso de tampão, coloque a membrana em uma folha de acetato com o lado do DNA voltado para cima. Adicione aproximadamente um a 1,5 mililitros de solução de substrato gota a gota na membrana.
Coloque imediatamente outra folha de acetato sobre ele e incube por cinco minutos à temperatura ambiente. Esprema a solução de substrato em excesso antes de obter imagens. Usando um sistema de imagem de documentação em gel, colete várias imagens não saturadas em diferentes pontos de tempo para análise.
Após o Southern blotting e hibridização, os fragmentos de restrição telomérica foram claramente visíveis, indicados por um esfregaço.
