No primeiro dia após a reticulação da cromatina e a coleta de núcleos de 5.000 vermes adultos jovens de Caenorhabditis Elegans, transfira a pelota de núcleos ressuspensa em 450 microlitros de água limpa para um tubo de microcentrífuga limpo de 1,5 mililitro. Em seguida, adicione 60 microlitros de tampão de enzima de restrição DPN2 10X e misture bem. Incubar as amostras com 15 microlitros de dodecil sulfato de sódio a 10% a 37 graus Celsius durante uma hora com agitação.
Apague a reação adicionando 75 microlitros de 20% de triton X 100 e incubando como demonstrado anteriormente. Alíquota 10 microlitros da amostra, como controle não digerido, e armazene-a a quatro graus Celsius. Depois de adicionar 400 unidades de DPN 2 ao resto da amostra, incube-a durante a noite a 37 graus Celsius com agitação para digestão da cromatina.
No segundo dia, adicione mais 200 unidades de DPN 2 à amostra. Para completar a digestão da amostra reticulada, incube-a a 37 graus Celsius com agitação por quatro horas. O calor inativa a enzima de restrição incubando a amostra por 20 minutos a 65 graus Celsius.
Se a enzima não puder ser inativada pelo calor, adicione 80 microlitros de dodecil sulfato de sódio a 10% e incube. Em seguida, adicione 375 microlitros de 20% Triton X 100 à amostra e misture girando. Mantenha de lado uma alíquota de 10 microlitros da amostra como controle de digestão.
Para a ligadura da cromatina, transfira a amostra para um tubo cônico limpo de 50 mililitros. Ajuste o volume da amostra para 5,7 mililitros com água de grau molecular e misture por rodopio. Em seguida, adicione 700 microlitros de tampão ligase 10 X T4, seguido por 60 unidades de DNA ligase T4, e incube a amostra durante a noite a 16 graus Celsius.
No terceiro dia, prossiga com a digestão de proteínas e reticulação reversa. Adicione 30 microlitros de 10 miligramas por mililitro de proteinase K à amostra de 3C e incube a 65 graus Celsius durante a noite com agitação. Para iniciar a purificação da biblioteca 3C no quarto dia, adicione 30 microlitros de 10 miligramas por mililitro de RNase A à amostra e misture girando.
Após a incubação, adicionar sete mililitros de fenil clorofórmio às amostras e misturar agitando. Centrifugar a amostra durante 15 minutos a 3, 270 G e temperatura ambiente. Recolher e transferir a fase aquosa para um tubo cónico limpo de 50 mililitros.
Adicionar volumes iguais de clorofórmio e misturar a amostra agitando. Depois de centrifugar a amostra novamente, conforme demonstrado, transfira a fase aquosa para outro tubo cônico limpo de 50 mililitros. Adicione 7,5 mililitros de água de grau molecular, 35 mililitros de etanol 100% e sete microlitros de um miligrama por mililitro de glicogênio.
Congelar a amostra devidamente misturada a menos 80 graus Celsius. Enquanto a amostra congela, comece a purificar as amostras de controle ajustando o volume dos controles para 500 microlitros usando água de grau molecular. Adicione dois microlitros de 10 miligramas por mililitro de RNase A e misture mexendo no tubo.
Em seguida, adicione um mililitro de fenil clorofórmio aos tubos que contêm os controles e misture agitando. Centrifugar os tubos. Depois de transferir a fase aquosa para um tubo de microcentrífuga limpo de 1,5 mililitro, adicione volumes iguais de clorofórmio.
Centrifugar como demonstrado anteriormente antes de coletar a fase aquosa. À fase aquosa coletada, adicionar um mililitro de etanol e dois microlitros de miligrama por mililitro de glicogênio. Depois de misturar a amostra agitando-a, incube-a a 80 graus Celsius negativos durante 30 minutos.
Em seguida, centrifugar a amostra por 15 minutos a 3.270 G a quatro graus Celsius. Após a remoção do sobrenadante, adicionar 750 microlitros de etanol 70% resfriado e centrífuga. Ressuspenda o pellet seco ao ar em 50 microlitros de água de grau molecular.
A suspensão pode ser congelada aqui se não prosseguir imediatamente. Para continuar com a purificação da amostra 3C, retire a amostra do congelador e centrifuja a 3, 270 G durante 30 minutos. Adicione 10 mililitros de etanol 70% resfriado e quebre a pelota de DNA.
Após centrifugação e remoção do sobrenadante, secar parcialmente a amostra à temperatura ambiente. Ressuspender o pellet em 150 microlitros de 10 milimolares tris HCL a pH 7,5 por pipetagem para cima e para baixo para obter a biblioteca 3C purificada. A QPCR realizada em uma amostra experimental e duas amostras 3C controle ajudou a gerar os dados de eficiência da digestão.
A amostra 3C apresentou uma eficiência de digestão de aproximadamente 88% nos sete locos genômicos testados.
