Este trabalho foi apoiado em parte pela Rhode Island Institutional Development Award (IDeA) Network of Biomedical Research Excellence do National Institute of General Medical Sciences dos National Institutes of Health sob o número de concessão P20GM103430 e pelo Bryant Center of Health and Behavioral Sciences.

Captura de Conformação Cromossômica (3C) para Pesquisa e Ensino de Graduação

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	<li>McBryant, S. J., Adams, V. H., Hansen, J. 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A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+density+and+transcription+influence+the+localization+of+chromatin+outside+of+chromosome+territories+detectable+by+FISH.">Gene density and transcription influence the localization of chromatin outside of chromosome territories detectable by FISH.</a> The Journal of Cell Biology. 159 (5), 753-763 (2002).</li><li>Li, B., Carey, M., Workman, J. 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J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+underlying+nucleosome+positioning+in+vivo.">Mechanisms underlying nucleosome positioning in vivo.</a> Annual Review of Biophysics. 43, 41-63 (2014).</li><li>Weiner, A., Hughes, A., Yassour, M., Rando, O. J., Friedman, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-resolution+nucleosome+mapping+reveals+transcription-dependent+promoter+packaging.">High-resolution nucleosome mapping reveals transcription-dependent promoter packaging.</a> Genome Research. 20 (1), 90-100 (2010).</li><li>Hughes, A. L., Jin, Y., Rando, O. J., Struhl, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+functional+evolutionary+approach+to+identify+determinants+of+nucleosome+positioning:+A+unifying+model+for+establishing+the+genome-wide+pattern.">A functional evolutionary approach to identify determinants of nucleosome positioning: A unifying model for establishing the genome-wide pattern.</a> Molecular Cell. 48 (1), 5-15 (2012).</li><li>Dekker, J., Rippe, K., Dekker, M., Kleckner, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Capturing+chromosome+conformation.">Capturing chromosome conformation.</a> Science. 295 (5558), 1306-1311 (2002).</li><li>van Berkum, N. L., Dekker, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Determining+spatial+chromatin+organization+of+large+genomic+regions+using+5C+technology.">Determining spatial chromatin organization of large genomic regions using 5C technology.</a> Methods in Molecular Biology. 567, 189-213 (2009).</li><li>Smith, E. M., Lajoie, B. R., Jain, G., Dekker, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Invariant+TAD+boundaries+constrain+cell-type-specific+looping+interactions+between+promoters+and+distal+elements+around+the+CFTR+locus.">Invariant TAD boundaries constrain cell-type-specific looping interactions between promoters and distal elements around the CFTR locus.</a> American Journal of Human Genetics. 98 (1), 185-201 (2016).</li><li>Crane, E. 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G., Felsenfeld, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+protein+CTCF+is+required+for+the+enhancer+blocking+activity+of+vertebrate+insulators.">The protein CTCF is required for the enhancer blocking activity of vertebrate insulators.</a> Cell. 98 (3), 387-396 (1999).</li><li>Cuadrado, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Specific+contributions+of+cohesin-SA1+and+cohesin-SA2+to+TADs+and+polycomb+domains+in+embryonic+stem+cells.">Specific contributions of cohesin-SA1 and cohesin-SA2 to TADs and polycomb domains in embryonic stem cells.</a> Cell Reports. 27 (12), 3500-3510 (2019).</li><li>Sarro, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Disrupting+the+three-dimensional+regulatory+topology+of+the+Pitx1+locus+results+in+overtly+normal+development.">Disrupting the three-dimensional regulatory topology of the Pitx1 locus results in overtly normal development.</a> Development. 145 (7), (2018).</li><li>Tolhuis, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interactions+among+polycomb+domains+are+guided+by+chromosome+architecture.">Interactions among polycomb domains are guided by chromosome architecture.</a> PLoS Genetics. 7 (3), e1001343 (2011).</li><li>Splinter, E., de Wit, E., van de Werken, H. J. G., Klous, P., de Laat, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Determining+long-range+chromatin+interactions+for+selected+genomic+sites+using+4C-seq+technology:+From+fixation+to+computation.">Determining long-range chromatin interactions for selected genomic sites using 4C-seq technology: From fixation to computation.</a> Methods. 58 (3), 221-230 (2012).</li><li>Fern&#225;ndez-Mi&#241;&#225;n, A., Bessa, J., Tena, J. J., G&#243;mez-Skarmeta, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chapter+21+-+Assay+for+transposase-accessible+chromatin+and+circularized+chromosome+conformation+capture,+two+methods+to+explore+the+regulatory+landscapes+of+genes+in+zebrafish.">Chapter 21 - Assay for transposase-accessible chromatin and circularized chromosome conformation capture, two methods to explore the regulatory landscapes of genes in zebrafish.</a> Methods in Cell Biology. 135, 413-430 (2016).</li><li>Dekker, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+three+&amp;#34;C&amp;#34;+s+of+chromosome+conformation+capture:+controls,+controls,+controls.">The three &amp;#34;C&amp;#34; s of chromosome conformation capture: controls, controls, controls.</a> Nature Methods. 3 (1), 17-21 (2006).</li><li>Hag&#232;ge, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+analysis+of+chromosome+conformation+capture+assays+(3C-qPCR).">Quantitative analysis of chromosome conformation capture assays (3C-qPCR).</a> Nature Protocols. 2 (7), 1722-1733 (2007).</li><li>Lajoie, B. R., van Berkum, N. L., Sanyal, A., Dekker, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=My5C:+Webtools+for+chromosome+conformation+capture+studies.">My5C: Webtools for chromosome conformation capture studies.</a> Nature Methods. 6 (10), 690-691 (2009).</li><li>Han, M., Wei, G., McManus, C. E., Hillier, L. W., Reinke, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolated+C.+elegans+germ+nuclei+exhibit+distinct+genomic+profiles+of+histone+modification+and+gene+expression.">Isolated C. elegans germ nuclei exhibit distinct genomic profiles of histone modification and gene expression.</a> BMC Genomics. 20 (1), 500 (2019).</li></ol>

Os autores declaram não haver conflitos de interesse.

O 3C é uma técnica poderosa que está enraizada em técnicas moleculares básicas. É essa base de ferramentas fundamentais que torna o 3C uma técnica tão intrigante para usar com alunos de graduação. Com tantos estudos recentes observando a dinâmica da cromatina em uma escala tão ampla, usar esses resultados para elaborar um experimento com foco restrito em um único gene ou região genômica tem o potencial de criar um experimento único e impactante na iniciação científica. Muitas vezes, experimentos como esses são considerados muito avançados para os graduandos, mas com um planejamento cuidadoso, eles são facilmente alcançáveis. É importante notar que os ensaios projetados para sondar as conexões de cromatina capturadas pela biblioteca 3C podem variar de PCR semiquantitativo final a sequenciamento do genoma inteiro. Na verdade, os dados do primeiro papel 3C16 foram gerados a partir de qPCR. Essa ampla gama de ensaios pode ser usada porque todas as tecnologias 3C produzem o mesmo produto - uma biblioteca de fragmentos de DNA representando conexões 3D no núcleo.
Apresenta-se aqui uma adaptação de um protocolo mais flexível e acomodado que melhor se adapta aos pesquisadores de graduação. Os períodos de pausa listados acima implicam atrasos durante a noite; No entanto, essas pausas podem se estender por finais de semana e, no caso das células e núcleos, por semanas. A consideração mais crucial é quando o trabalho será feito. Muitas vezes, em protocolos, há etapas sensíveis ao tempo quando a pausa não é uma opção. Fora alguns pontos (dia 1 e dia 2), há muitos lugares para parar e congelar a amostra. Estes são críticos quando se trabalha com estudantes de graduação, onde os horários e horários do trabalho de laboratório precisam ser flexíveis. Além de engendrar essas paradas no protocolo, os graduandos são incentivados a trabalhar em duplas ou mesmo pequenos grupos de três ou quatro. Os grupos funcionam bem para esse protocolo, pois os alunos podem apoiar uns aos outros e criar um sistema de amigos para que todos estejam trabalhando com segurança. O trabalho de laboratório também é mais divertido com os outros envolvidos. Com os grupos, os alunos também podem trabalhar uma variedade de questões focadas na organização da cromatina enquanto ainda realizam o mesmo protocolo. Assim, mesmo enquanto os alunos estão trabalhando em projetos separados, o protocolo vincula seus esforços e, por isso, eles podem apoiar uns aos outros.
Outras adaptações visam contornar o fato de que certas ferramentas e equipamentos especializados não são necessariamente encontrados em todas as instituições de graduação. Esses equipamentos incluem, mas não estão limitados a termocicladores qPCR, sistemas de documentação de gel e espectrômetros de nanovolume. Na verdade, esses equipamentos são convenientes, mas não são uma exigência. Aqui, o método clássico do 3C também é descrito na parte de design do primer; Isso envolve a identificação de um locus genômico de interesse e, a partir disso, a avaliação de outros loci genômicos para pontos de contato com a cromatina mais distantes. Essa técnica também funciona bem se um conjunto de dados publicado for usado, como um conjunto de dados usando Hi-C, onde loci positivos (conectando) e negativos (não conectando) conhecidos são identificados. Projetar experimentos usando esses conjuntos de dados publicados é outra ótima adaptação para laboratórios de ensino, pois a chance de sucesso na identificação de conexões de cromatina é geralmente maior. Além disso, o artigo de pesquisa pode ser discutido em sala de aula e ser utilizado como referência.
Este protocolo usa uma abordagem de qPCR modificada para visualizar a formação do produto 3C. Os controles são essenciais para o sucesso da técnica 3C. Cada experimento usa controles de amostra e controles de primer para determinar a conclusão do procedimento 3C. Os controles da amostra incluem um controle não digerido (DNA genômico) e um controle digerido. O controle não digerido determina o sinal basal para os conjuntos de primers e é usado com o controle de digestão reticulado para determinar a eficiência da digestão Espera-se que haja uma queda no produto para quaisquer primers direcionados através de um local de restrição. A comparação desse valor com o controle não digerido fornece uma indicação de quão bem a amostra foi digerida.
Os primers para a PCR incluem um primer de controle e primers de teste. O primer controle é um conjunto de primers que está próximo à região genômica que está sendo ensaiada e não contém um local de restrição. Isso fornece a linha de base para determinar a abundância dos produtos de PCR do primer de teste. Os primers de teste são primers para frente e para trás que ladeiam um local de restrição para um determinado locus genômico de interesse (Figura 3). As reações usando esses conjuntos de primers são comparadas para determinar a eficiência da digestão, pois a abundância do produto deve cair se o local de restrição tiver sido cortado. Na determinação da organização da cromatina, um primer de teste de um locus é emparelhado com outro primer de teste de um locus genômico diferente para determinar se esses dois loci estão próximos no espaço 3D. Nesse caso, a expectativa é que um produto de PCR só seja encontrado usando a amostra 3C como modelo.
É importante notar que mesmo os primers validados têm a tendência de falhar (Figura 4: conjunto de primers r14). Além disso, os produtos de PCR são frequentemente identificados em reações de controle e em reações nas quais uma conexão de cromatina não é prevista (como o controle digerido, uma vez que não é ligado). Essas instâncias são sequenciadas e falham no QC do Sanger ou retornam sem uma sequência definida (Figura 5). Além disso, os experimentos tradicionais em 3C geram um "modelo de controle", uma amostra de DNA não cruzada, digerida e ligada, que representa todos os possíveis fragmentos ligados que podem ser produzidos com uma determinada quantidade de DNA. O "modelo de controle" desempenha um papel importante na comparação das intensidades dos sinais de qPCR entre dois loci genômicos para determinar se o sinal representa uma interação verdadeira ou apenas uma associação aleatória. Criar um "modelo de controle" pode ser problemático, pois uma grande parte da cromatina que está sendo ensaiada deve ser capturada na forma de um cromossomo artificial e processada junto com as amostras 3C. Garantir tal construção pode não ser viável, e criar uma pode estar fora do escopo de um projeto semestral. Devido a essas dificuldades, sugere-se o uso de um primer controle. O primer de controle não substitui toda a funcionalidade do "modelo de controle", mas ainda fornece a oportunidade de analisar os dados para fazer determinações de "presença" ou "ausência".
Ao realizar qPCR, o uso de quantidades iguais da amostra é importante. Isso deve ser determinado, mesmo usando um nanoespectrofotômetro como uma nanogota, gerando uma curva padrão a partir do DNA genômico de uma concentração conhecida e ajustando as amostras de 3C a essa linha. Essas quantidades devem ser registradas e usadas em PCRs subsequentes. A qualidade da reação de PCR também é importante. Como a PCR é executada em qPCR, a abundância do produto é medida usando fluorescência e registrada. Esta gravação é acessível no gráfico de amplificação. Uma vez terminado o programa, é importante verificar o gráfico de amplificação e garantir que as reações (exceto os controles sem modelo) tenham três fases: uma linha de base, uma exponencial e uma fase de platô/saturação. É importante verificar se as reações têm uma fase exponencial, em particular para a definição do limiar (ver abaixo). Além disso, para amostras diluídas em série, deve haver uma mudança nos valores de Ct consistente com a diluição da amostra (a concentração mais alta terá os menores valores de Ct, enquanto a menor concentração terá os maiores valores de Ct). Amostras que não refletem essa mudança no gráfico de amplificação requerem uma nova diluição ou indicam um problema maior com a formação da amostra 3C. Finalmente, ao gerar a curva padrão, o software PCR calculará a eficiência da PCR e o valor de R2 . A eficiência da PCR deve ser maior que 90%, e o valor de R2 deve ser maior que 0,99. Se qualquer uma dessas condições não for atendida, é provável que algo esteja errado com a amostra ou os primers do PCR.
Após a qPCR, a porcentagem de digestão e a presença de interações 3C podem ser calculadas usando o qPCR Ct para cada reação. Para determiná-los, primeiro, o limiar para a reação de PCR deve ser definido. Isso normalmente é feito usando o software que vem com a máquina qPCR. A definição do limiar definirá a concentração do produto de PCR que será usado para comparar os valores de Ct da amostra. O limiar deve bissetriz as curvas de amplificação das reações de PCR na fase exponencial de amplificação. Somente as reações de PCR com amplificação exponencial podem ser comparadas (neste caso, os primers de controle e as reações de primer teste), pois esta é a única maneira de garantir que as reações estejam amplificando o DNA na mesma taxa e possam ser comparadas fielmente. Ao analisar os gráficos 3C, as reações condicionalmente positivas são identificadas como aquelas com mais produto do que as amostras controle, o controle genômico e o controle da digestão (Figura 4B). No entanto, essas amostras devem ser validadas usando o sequenciamento de Sanger após a purificação em gel do produto de PCR.
Após o sequenciamento de Sanger, as amostras que passam pelo CQ podem ser analisadas usando Blat. O objetivo desta análise é determinar se a amostra possui a sequência de ambos os loci genômicos alvo flanqueando o sítio de restrição (DpnII no caso deste protocolo). Se ambas as sequências forem identificadas, o fragmento 3C pode ser considerado validado. Se os resultados do Blat não retornarem a sequência esperada, isso pode indicar que um ou ambos os primers não são ideais, resultando em um resultado falso positivo de qPCR. Os arquivos de rastreamento para as amostras falso-positivas terão picos de base indefinidos, e os relatórios Seq conterão principalmente "n" chamadas de base.
A validação de Sanger é essencial, pois falsos positivos da formação de produtos de PCR artefactuais são possíveis. Esses falsos positivos podem ser identificados quando os produtos de sequenciamento não têm a sequência alvo esperada ou um sítio DpnII característico de um fragmento 3C adequado (Figura 5). O sequenciamento dos fragmentos de PCR também fornece outro ponto de dados para o experimento e mostra aos alunos que a técnica 3C está identificando loci genômicos distantes que estão se juntando no espaço 3D dentro dos núcleos.
A técnica 3C fornece uma riqueza de técnicas moleculares fundamentais para estudantes de graduação em um procedimento flexível e direto. Esta técnica 3C também é um ponto de partida para as outras técnicas 3C que incorporam sequenciamento de próxima geração (NGS). Esses tipos de experimentos podem expor os graduandos a aspectos importantes da bioinformática e estão enraizados nos princípios básicos aqui descritos. A experiência e o envolvimento na graduação são fundamentais para seu sucesso e desenvolvimento como jovens cientistas. Ao oferecer essas oportunidades, os graduandos podem fortalecer sua compreensão dos princípios básicos e, ao mesmo tempo, construir sua confiança para lidar com técnicas e questões de ponta.

O genoma de um organismo não só contém todos os genes necessários para a função, mas também todas as instruções sobre como e quando usá-los. Isso faz com que regular o acesso ao genoma seja uma das funções mais importantes da célula. Existem muitos mecanismos para controlar a função gênica; no entanto, em seu nível básico, a regulação gênica se resume à capacidade dos fatores de transcrição regulatórios (trans-fatores) de se ligarem às suas sequências específicas de DNA (sequências cis-regulatórias). Esta não é uma habilidade inata; em vez disso, é governada pela organização/estrutura do genoma no núcleo, que controla a disponibilidade/exposição das sequências cis-regulatórias aos trans-fatores 1,2,3. Se os trans-fatores não podem encontrar suas sequências cis-regulatórias, então os trans-fatores não podem executar suas tarefas regulatórias. Isso tornou a compreensão de como os genomas estão organizados no núcleo uma importante fonte de investigação.
É amplamente aceito que, durante a interfase, os cromossomos eucarióticos no núcleo ocupam seu próprio domínio ancorados à lâmina nuclear e à matriz nuclear (Figura 1), tornando o cromossomo mais parecido com uma fatia de pizza do que com um macarrão em um prato de espaguete. Os cromossomos são parcialmente condensados por interações proteína-DNA (cromatina) que torcem e fazem loop de porções do cromossomo. Através de microscopia eletrônica, fluorescência tridimensional do DNA hibridização in situ (FISH) e técnicas de marcação de DNA (i.e., metilação fluorescente e artificial do DNA), domínios inativos da cromatina foram encontrados firmemente embalados ao longo da periferia nuclear 4,5,6, enquanto porções de cromatina ativa menos condensada são encontradas no interior do núcleo 7,8,9, 10º. Esses experimentos fornecem uma visão grande angular da dinâmica cromossômica, mas pouco fazem para capturar as mudanças que ocorrem localmente ao redor dos promotores gênicos observados nos estudos com DNase11,12 e nucleossomo13,14,15.
A chave para desbloquear a dinâmica da cromatina de alta resolução foi a formulação da técnica de mapeamento cromossômico 3D, 3C. A técnica 3C propriamente dita compreende quatro etapas principais: reticulação da cromatina, digestão da cromatina por enzimas de restrição, ligadura da cromatina e purificação do DNA (Figura 2). Os novos fragmentos artificiais de DNA gerados por esse processo podem então ser caracterizados para revelar a estreita associação física entre pedaços linearmente distantes de DNA16. A técnica 3C tornou-se a base para a criação de múltiplas técnicas derivadas que utilizam os passos iniciais do 3C para fazer perguntas mais amplas sobre o genoma (por exemplo, Hi-C, 4C, ChIP-C). Esta família de técnicas 3C identificou que os cromossomos são organizados em múltiplas unidades discretas denominadas domínios topologicamente associados (DATs). As DATs são codificadas no genoma e definidas por alças de cromatina flanqueadas por limites não loopados16,17,18,19. Os limites das DAT são mantidos por dois fatores evolutivamente conservados e ubíquos, incluindo o fator de ligação da TCCCT (CTCF) e a coesão, que impedem que laços dentro de DATs separadosinterajam 16,20. As alças são mediadas pela interação de transfatores com suas sequências regulatórias, assim como a TCCF e a coesão21.
Embora muitos estudos usando tecnologias 3C façam perguntas amplas sobre o genoma e empreguem técnicas complicadas de coleta de amostras, a formulação da técnica 3C é baseada em técnicas básicas de biologia molecular. Isso torna o 3C intrigante para implantação em laboratórios de iniciação científica e ensino. A técnica 3C pode ser empregada para questões focadas menores e é inerentemente flexível para escalar para cima ou para baixo (genes únicos22, cromossomos16 e/ou genomas18), dependendo do foco e direção das perguntas feitas. Essa técnica também tem sido aplicada a uma ampla gama de sistemas modelo7,16,19,23 e tem se mostrado versátil em seu uso. Isso torna o 3C uma excelente técnica para graduandos, na medida em que os alunos podem ganhar experiência em técnicas comuns de biologia molecular, ao mesmo tempo em que ganham experiência valiosa em responder a perguntas direcionadas.
Apresenta-se um protocolo adaptado para preparação de biblioteca 3C baseado em protocolos previamente publicados24,25,26,27. Este protocolo foi otimizado para aproximadamente 1 × 107 células, embora tenha gerado bibliotecas 3C com apenas 1 × 105 células. Este protocolo provou ser versátil e tem sido usado para gerar bibliotecas 3C a partir de embriões de peixe-zebra, linhagens celulares de peixe-zebra e filho-adulto (YA) Caenorhabditis elegans (lombriga). O protocolo também deve ser apropriado para linhagens celulares de mamíferos e, com maior adaptação, leveduras.
O objetivo dessas adaptações é tornar o 3C mais acessível para os graduandos. Tem-se tido o cuidado de utilizar técnicas semelhantes àquelas que podem ser realizadas em um laboratório de ensino de graduação. A técnica 3C oferece muitas oportunidades de aprendizado para os alunos de graduação aprenderem técnicas básicas de biologia molecular que beneficiarão seu desenvolvimento na bancada, na sala de aula e em seus esforços após a graduação.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>37% Formaldehyde&#160;</td>
			<td>Millapore-Sigma</td>
			<td>F8775</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100% Ethanol</td>
			<td>Millapore-Sigma</td>
			<td>E7023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCl2</td>
			<td>MP Biomedical</td>
			<td>215350280</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>chloroform</td>
			<td>Millapore-Sigma</td>
			<td>C0549</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cOmplete, EDTA-free Protease Inhibitor Cocktail</td>
			<td>Millapore-Sigma</td>
			<td>COEDTAF-RO</td>
			<td>mixed to 50x in water. Diluted to 1x in Sucrose buffer and GB buffer fresh</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dithiothreitol (DTT)</td>
			<td>Millapore-Sigma</td>
			<td>D0632</td>
			<td>1 M stock diluted to 500 &#181;M in Sucrose buffer and GB buffer fresh</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DpnII</td>
			<td>NEB</td>
			<td>R0543M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Millapore-Sigma</td>
			<td>G9012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>glycine</td>
			<td>Millapore-Sigma</td>
			<td>G8898</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>glycogen</td>
			<td>Millapore-Sigma</td>
			<td>10901393001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Millapore-Sigma</td>
			<td>H3375</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>Millapore-Sigma</td>
			<td>P3911</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KH2PO4</td>
			<td>Millapore-Sigma</td>
			<td>P5655</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>methyl green pyronin&#160;&#160;</td>
			<td>Millapore-Sigma</td>
			<td>HT70116</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgAc2</td>
			<td>Thermoscientific</td>
			<td>1222530</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na2HPO4</td>
			<td>Millapore-Sigma</td>
			<td>S5136</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Millapore-Sigma</td>
			<td>S9888</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>phenol-chloroform&#160;</td>
			<td>Millapore-Sigma</td>
			<td>P3803</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pronase</td>
			<td>Millapore-Sigma</td>
			<td>11459643001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Proteinase K</td>
			<td>IBI Scientific</td>
			<td>IB05406</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>qPCR Ready mix (Phire Taq etc)</td>
			<td>Millapore-Sigma</td>
			<td>KCQS07</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNase A&#160;</td>
			<td>Millapore-Sigma</td>
			<td>R6148</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Acetate</td>
			<td>Millapore-Sigma</td>
			<td>S2889</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sodium dodecyl sulfate (SDS)</td>
			<td>Millapore-Sigma</td>
			<td>L3771</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Millapore-Sigma</td>
			<td>S0389</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T4 DNA Ligase</td>
			<td>Promega</td>
			<td>M1804</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris-HCl</td>
			<td>Millapore-Sigma</td>
			<td>108319</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Millapore-Sigma</td>
			<td>T9284</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA&#160;</td>
			<td>Millapore-Sigma</td>
			<td>T4049</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

getting an a with the 3cs: chromosome conformation capture for undergraduates

A captura de conformação cromossômica (3C) é uma ferramenta poderosa que gerou uma família de técnicas semelhantes (por exemplo, Hi-C, 4C e 5C, referidas aqui como técnicas 3C) que fornecem informações detalhadas da organização tridimensional da cromatina. As técnicas 3C têm sido utilizadas em uma ampla gama de estudos, desde o monitoramento das mudanças na organização da cromatina em células cancerosas até a identificação de contatos intensificadores feitos com promotores gênicos. Embora muitos dos estudos usando essas técnicas estejam fazendo grandes perguntas sobre o genoma com tipos de amostra intrincados (ou seja, análise de célula única), o que muitas vezes se perde é que as técnicas 3C são fundamentadas em métodos básicos de biologia molecular que são aplicáveis a uma ampla gama de estudos. Ao abordar questões fortemente focadas na organização da cromatina, esta técnica de ponta pode ser usada para melhorar a experiência de laboratório de pesquisa e ensino de graduação. Este artigo apresenta um protocolo 3C e fornece adaptações e pontos de ênfase para implementação em instituições de ensino e pesquisa de graduação.

An organism&#39;s genome not only holds all the genes required for function but also all the instructions on how and when to use them. This makes regulating access to the genome one of the most important functions of the cell. There are many mechanisms to control gene function; however, at its base level, gene regulation comes down to the ability of regulatory transcription factors (trans-factors) to bind to their specific DNA sequences (cis-regulatory sequences). This is not an innate ability; instead, it is governed by the organization/structure of the genome in the nucleus, which controls the availability/exposure of the cis-regulatory sequences to the trans-factors1,2,3. If the trans-factors cannot find their cis-regulatory sequences, then the trans-factors cannot perform their regulatory tasks. This has made understanding how genomes are organized in the nucleus an important source of inquiry.
It is widely accepted that during interphase, eukaryotic chromosomes in the nucleus occupy their own domain anchored to the nuclear lamina and nuclear matrix (Figure 1), thus making the chromosome more like a slice of pizza, rather than a noodle on a plate of spaghetti. Chromosomes are partially condensed by protein-DNA interactions (chromatin) that twist and loop portions of the chromosome. Through electron microscopy, three-dimensional DNA fluorescence in situ hybridization (FISH), and DNA tagging techniques (i.e., fluorescent and artificial DNA methylation), inactive domains of chromatin have been found to be packed tightly along the nuclear periphery4,5,6, while portions of active, less condensed chromatin are found in the interior of the nucleus7,8,9,10. These experiments provide a wide-angle view of chromosome dynamics but do little to capture the changes that occur locally around the gene promotors observed in DNase11,12 and nucleosome13,14,15 studies.
The key to unlocking higher-resolution chromatin dynamics was the formulation of the 3D chromosome mapping technique, 3C. The 3C technique itself comprises four main steps: crosslinking of chromatin, chromatin digestion by restriction enzymes, chromatin ligation, and DNA purification (Figure 2). The new artificial DNA fragments generated by this process can then be characterized to reveal the close physical association between linearly distant pieces of DNA16. The 3C technique became the basis for the creation of multiple spin-off techniques that utilize the initial steps of 3C to ask broader genome-wide questions (e.g., Hi-C, 4C, ChIP-C). This family of 3C techniques has identified that chromosomes are organized into multiple discrete units termed topologically associated domains (TADs). TADs are encoded in the genome and are defined by chromatin loops flanked by unlooped boundaries16,17,18,19. The TAD boundaries are maintained by two evolutionarily conserved and ubiquitous factors, including CCCT binding factor (CTCF) and cohesion, which prevent loops within separate TADs from interacting16,20. The loops are mediated by the interaction of trans-factors with their regulatory sequences, as well as CTCF and cohesion21.
Though many studies using 3C technologies ask broad genome-wide questions and employ complicated sample collection techniques, the formulation of the 3C technique is based on basic molecular biology techniques. This makes 3C intriguing for deployment in both undergraduate research and teaching labs. The 3C technique can be employed for smaller focused questions and is inherently flexible to scaling up or down (single genes22, chromosomes16, and/or genomes18) depending on the focus and direction of the questions asked. This technique has also been applied to a wide range of model systems7,16,19,23 and has been proven to be versatile in its use. This makes 3C an excellent technique for undergraduates in that students can gain experience in common molecular biology techniques while also gaining valuable experience in answering directed questions.
Presented here is an adapted protocol for 3C library preparation based on previously published protocols24,25,26,27. This protocol has been optimized for approximately 1 &#215; 107 cells, though it has generated 3C libraries with as little as 1 &#215; 105 cells. This protocol has proven to be versatile and has been used to generate 3C libraries from zebrafish embryos, zebrafish cell lines, and young-adult (YA) Caenorhabditis elegans (roundworm). The protocol should also be appropriate for mammalian cell lines and, with further adaptation, yeast.
The goal of these adaptations is to make 3C more accessible for undergraduates. Care has been taken to use techniques that are similar to those that can be accomplished in an undergraduate teaching laboratory. The 3C technique provides many learning opportunities for undergraduates to learn basic molecular biology techniques that will benefit their development at the bench, in the classroom, and in their endeavors after graduation.

Autor em destaque: Obtendo um A com os 3Cs: Captura de conformação cromossômica para alunos de graduação  

Obtendo um A com os 3Cs: Captura de Conformação Cromossômica para Graduandos

Our research aims to uncover how chromatin organization controls gene expression. The focus is on determining what factors regulate chromatin at the gene level to control gene activity. Currently, technologies similar to chromosome confirmation capture, or 3C, are used to make progress in this field.Investments in sample collection and sequencing technologies have pushed us what the 3C techniques can show us. The greatest experimental challenge currently is collecting samples having uniform chromatin architecture. Heterogeneity in samples leads to confounding results.In the future, we'll be focusing on how changes in chromatin organization play a role in cancer.

Este procedimento produzirá uma amostra experimental de 3C e duas amostras controle (não digeridas e digeridas). Utilizando essas três amostras, foi realizada qPCR. A partir desses resultados, a eficiência da digestão foi calculada (equação 1) e registrada (Tabela 1). A partir desses cálculos, determinou-se que a amostra 3C apresentou aproximadamente 88% de eficiência de digestão (média da Tabela 1) nos sete loci genômicos testados.
Em seguida, as amostras foram testadas para a presença de contatos de cromatina de longo alcance entre os diferentes loci genômicos usando combinações de primers loci específicos (Tabela 2) e qPCR. Com esses resultados, as abundâncias de produtos relativas a um conjunto de primers controle foram calculadas (equação 2) e grafadas para comparação (Figura 4). Esses dados indicaram que 8 das 10 reações foram condicionais positivas para interações de longo alcance.
As reações de PCR foram então executadas em gel de agarose. O produto de PCR esperado para os oito positivos condicionais e uma reação negativa foram purificados em gel e enviados para sequenciamento de Sanger. Os resultados para as reações representativas positivas (seta azul, caixa azul) e negativas (seta vermelha, caixa vermelha) são mostrados (Figura 5).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65213/65213fig01.jpg"> Figura 1: Estrutura cromossômica no núcleo. Organização cromossômica hipotética dentro do núcleo. (A) Envelope nuclear, linhas pretas; (B) lâmina nuclear, laranja; (C) heterocromatina, linhas compactadas; (D) eucromatina, laços soltos. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65213/65213fig01large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65213/65213fig02.jpg"> Figura 2: Esquema do protocolo 3C. Porções distantes de cromossomos lineares (azul, amarelo e rosa) são aproximadas dentro do núcleo através de laços regulatórios. (A) As estruturas das alças são mediadas por fatores de transcrição (círculo cinza e estrela preta); Essas interações são preservadas através de reticulação química. (B) As alças são quebradas através da digestão enzimática (linhas pretas). (C) Pedaços distantes de cromatina são ligados entre si através das extremidades de aderência criadas pela digestão. (D) O DNA é purificado a partir de proteínas. (E) A sequência dentro dos fragmentos é identificada e mapeada de volta ao genoma. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65213/65213fig02large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65213/65213fig03.jpg"> Figura 3: O esquema de primers 3C. Os primers 3C são projetados em torno de locais de restrição a distâncias variáveis do local genômico de interesse. As setas rosas representam os conjuntos de primers experimentais que circundam um sítio DpnII. Os primers experimentais podem ser misturados e combinados para avaliar o looping da cromatina na região. Os primers laranja representam um controle negativo sem um sítio DpnII. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65213/65213fig03large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65213/65213fig04.jpg"> Figura 4: Dados representativos de qPCR para um experimento 3C. Abundância relativa dos conjuntos de primers teste 3C. (A) Gráfico de controle mostrando a abundância relativa do produto na amostra controle não digerida (azul), controle digerido (cinza) e 3C (laranja). (B) O experimento 3C; a abundância relativa do produto a partir de combinações de primers de teste na amostra controle não digerido (azul), controle digerido (cinza) e 3C (laranja). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65213/65213fig04large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65213/65213fig05.jpg"> Figura 5: Visualização dos produtos 3C qPCR. Superior, gel com os produtos de endpoint qPCR com as amostras indicadas. Abaixo, arquivos de rastreamento de sequência de Sanger representativos para as reações indicadas. A amostra laranja é um exemplo de falso positivo (ver Figura 4, r38/34), e a amostra azul é um exemplo de um verdadeiro positivo com o sítio DpnII indicado acima do traço. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65213/65213fig05large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td>Local</td>
			<td>% digestão</td>
		</tr><tr><td>R8</td>
			<td>86.98</td>
		</tr><tr><td>R3</td>
			<td>88.44</td>
		</tr><tr><td>r38</td>
			<td>89.64</td>
		</tr><tr><td>r34</td>
			<td>87.55</td>
		</tr><tr><td>r33</td>
			<td>87.85</td>
		</tr><tr><td>r14</td>
			<td>86.97</td>
		</tr><tr><td>r47</td>
			<td>89.45</td>
		</tr></tbody></table>Tabela 1: Eficiência de digestão calculada.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td>Nome</td>
			<td colspan="3">Seqüenciar</td>
			<td>Loci genômicos</td>
		</tr><tr><td>r3 FWD</td>
			<td colspan="3">ACGCAAGTAAAATTCTGGTTTTTGACC</td>
			<td>chrX:11361475</td>
		</tr><tr><td>RVS r3</td>
			<td colspan="3">TTTCCTGAGCTCTAACCATGTTTGC</td>
			<td>chrX:11361561</td>
		</tr><tr><td>r38 FWD</td>
			<td colspan="3">TTACTTCTGAAGTAATCTTTTCTTATCCCC</td>
			<td>chrX:5859700</td>
		</tr><tr><td>RVS r38</td>
			<td colspan="3">AGACGAGCTGATTAAAAGTAGTTGAGAG</td>
			<td>chrX:5859775</td>
		</tr><tr><td>r34 FWD</td>
			<td colspan="3">ATTTGTGGATTGCGTGGAGACG</td>
			<td>chrX:5429702</td>
		</tr><tr><td>RVS r34</td>
			<td colspan="3">AATAATCCTCTTAACAAACGTGGCC</td>
			<td>chrX:5429777</td>
		</tr><tr><td>r33 FWD</td>
			<td colspan="3">AAGAGTTGTCCAAAATAAATTGAGCTAAC</td>
			<td>chrX:6296704</td>
		</tr><tr><td>RVS r33</td>
			<td colspan="3">TTCAGAAAAGTAAACTTTGACTTGGAACG</td>
			<td>chrX:6296807</td>
		</tr><tr><td>r14 FWD</td>
			<td colspan="3">AATTATCGATTTTTCCATCGCGCAG</td>
			<td>chrX:8036367</td>
		</tr><tr><td>RVS r14</td>
			<td colspan="3">ATTTCAATGAAAATGTAAAAATGTTCCTTC</td>
			<td>chrX:8036427</td>
		</tr><tr><td>r47 FWD</td>
			<td colspan="3">ATCTAGACTTGATAATATTTGTGTGTCCTC</td>
			<td>chrX:9464939</td>
		</tr><tr><td>RVS r47</td>
			<td colspan="3">AAGTTCTGCAACTGTTAGATGAATAACAC</td>
			<td>chrX:9465064</td>
		</tr><tr><td>r8 FWD</td>
			<td colspan="3">GAGAATGTTGTTCTGTAACTGAAAACTTG</td>
			<td>chrX:11094257</td>
		</tr><tr><td>RVS r8</td>
			<td colspan="3">TTACGAAATTTGGTAGTTTTGGACC</td>
			<td>chrX:11094362</td>
		</tr><tr><td>Primer de controle FWD</td>
			<td colspan="3">CAATCGTCTCGCTCACTTGTC</td>
			<td>chrX:7608049</td>
		</tr><tr><td>Primer de controle RVS</td>
			<td colspan="3">GATGTGAGCAACAAGGCACC</td>
			<td>chrX:7608166</td>
		</tr></tbody></table>Tabela 2: Primers para o experimento representativo 3C.

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Aqui, apresentamos uma adaptação da técnica de captura da conformação cromossômica (3C) em detalhes com ênfase no envolvimento e aprendizagem da graduação.

Chromosome conformation capture (3C) is a powerful tool that has spawned a family of similar techniques (e.g., Hi-C, 4C, and 5C, referred to here as 3C ...

Nossa pesquisa visa descobrir como a organização da cromatina controla a expressão gênica. O foco é determinar quais fatores regulam a cromatina no nível do gene para controlar a atividade gênica. Atualmente, tecnologias semelhantes à captura de confirmação cromossômica, ou 3C, são usadas para avançar nesse campo.Os investimentos em tecnologias de coleta e sequenciamento de amostras nos impulsionaram o que as técnicas 3C podem nos mostrar. O maior desafio experimental atualmente é a coleta de amostras com arquitetura uniforme de cromatina. A heterogeneidade nas amostras leva a resultados confusos.No futuro, vamos nos concentrar em como as mudanças na organização da cromatina desempenham um papel no câncer.

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Research

JoVE Journal

Genetics

Getting an A with the 3Cs: Chromosome Conformation Capture for Undergraduates

2.1K visualizações.  Bryant University. Nossa pesquisa visa descobrir como a organização da cromatina controla a expressão gênica. O foco é determinar quais fatores regulam a cromatina no nível do gene para controlar a atividade gênica. Atualmente, tecnologias semelhantes à captura de confirmação cromossômica, ou 3C, são usadas para avançar nesse campo.Os investimentos em tecnologias de coleta e sequenciamento de amostras nos impulsionaram o que as técnicas 3C podem nos mostrar. O maior desafio experimental atu...

Vídeo: Autor em destaque: Obtendo um A com os 3Cs: Captura de conformação cromossômica para alunos de graduação  

Chromosome conformation capture (3C) is a powerful tool that has spawned a family of similar techniques (e.g., Hi-C, 4C, and 5C, referred to here as 3C techniques) that provide detailed information of the three-dimensional organization of chromatin. The 3C techniques have been used in a wide range of studies, from monitoring the changes in chromatin organization in cancer cells to identifying enhancer contacts made with gene promoters. While many of the studies using these techniques are asking big genome-wide questions with intricate sample types (i.e., single-cell analysis), what is often lost is that the 3C techniques are grounded in basic molecular biology methods that are applicable to a broad range of studies. By addressing tightly focused questions of chromatin organization, this cutting-edge technique can be used to enhance the undergraduate research and teaching lab experience. This paper presents a 3C protocol and provides adaptations and points of emphasis for implementation at primarily undergraduate institutions in undergraduate research and teaching experiences.

Here, we present an adaption of the chromosome conformation capture (3C) technique in detail with an emphasis on undergraduate involvement and learning.

Genética

Generation and Purification of Chromosome Conformation Capture (3C) Library

On day one after chromatin cross-linking and nuclei collection from 5, 000 young adult Caenorhabditis Elegans worms, transfer the nuclei pellet re-suspended in 450 microliters of clean water to a clean 1.5 milliliter micro centrifuge tube. Then add 60 microliters of 10X DPN2 restriction enzyme buffer to it and mix well. Incubate the samples with 15 microliters of 10%sodium dodecyl sulfate at 37 degrees Celsius for one hour with agitation.Quench the reaction by adding 75 microliters of 20%triton X 100 and incubating as demonstrated previously. Aliquot 10 microliters from the sample, as the undigested control, and store it at four degrees Celsius. After adding 400 units of DPN 2 to the rest of the sample, incubate it overnight at 37 degrees Celsius with agitation for chromatin digestion.On day two, add an additional 200 units of DPN 2 to the sample. To complete the digestion of the cross-linked sample, incubate it at 37 degrees Celsius with agitation for four hours. Heat inactivate the restriction enzyme by incubating the sample for 20 minutes at 65 degrees Celsius.If the enzyme cannot be inactivated by heat, add 80 microliters of 10%sodium dodecyl sulfate and incubate. Then, add 375 microliters of 20%Triton X 100 to the sample and mix by swirling. Keep aside a 10 microliter aliquot from the sample as the digestion control.For chromatin ligation, transfer the sample to a clean 50 milliliter conical tube. Adjust the sample volume to 5.7 milliliters with molecular grade water and mix by swirling. Then, add 700 microliters of 10 X T4 ligase buffer, followed by 60 units of T4 DNA ligase, and incubate the sample overnight at 16 degrees Celsius.On day three, proceed with protein digestion and reverse cross-linking. Add 30 microliters of 10 milligrams per milliliter Proteinase K to the 3C sample and incubate at 65 degrees Celsius overnight with agitation. To begin purification of the 3C library on day four, add 30 microliters of 10 milligrams per milliliter RNase A to the sample and mix by swirling.After incubation, add seven milliliters of phenyl chloroform to the samples and mix by shaking. Centrifuge the sample for 15 minutes at 3, 270 G and room temperature. Collect and transfer the aqueous phase to a clean 50 milliliter conical tube.Add equal volumes of chloroform and mix the sample by shaking. After centrifuging the sample again as demonstrated, transfer the aqueous phase to another clean 50 milliliter conical tube. Add 7.5 milliliters of molecular grade water, 35 milliliters of 100%ethanol and seven microliters of one milligram per milliliter Glycogen.Freeze the properly mixed sample at minus 80 degrees Celsius. While the sample freezes, begin purifying the control samples by adjusting the volume of the controls to 500 microliters using molecular grade water. Add two microliters of 10 milligrams per milliliter RNase A and mix by flicking the tube.Next, add one milliliter of phenyl chloroform to the tubes containing the controls and mix by shaking. Centrifuge the tubes. After transferring the aqueous phase to a clean 1.5 milliliter micro centrifuge tube, add equal volumes of chloroform.Centrifuge as previously demonstrated before collecting the aqueous phase. To the collected aqueous phase, add one milliliter of ethanol and two microliters of one milligram per milliliter glycogen. After mixing the sample by shaking, incubate it at minus 80 degrees Celsius for 30 minutes.Next, centrifuge the sample for 15 minutes at 3, 270 G at four degrees Celsius. After removing the supernatant, add 750 microliters of chilled 70%ethanol and centrifuge. Re-suspend the air dried pellet in 50 microliters of molecular grade water.The suspension can be frozen here if not proceeding further immediately. To continue with the 3C sample purification, remove the sample from the freezer and centrifuge at 3, 270 G for 30 minutes. Add 10 milliliters of chilled 70%ethanol and break up the DNA pellet.After centrifuging and removing the supernatant, partially air dry the sample at room temperature. Re suspend the pellet in 150 microliters of 10 millimolar tris HCL at pH 7.5 by pipetting up and down to obtain the purified 3C library. QPCR performed on the one experimental and two control 3C samples helped generate the digestion efficiency data.The 3C sample had an approximately 88%digestion efficiency across the seven genomic loci tested.

Biblioteca de Geração e Purificação de Captura de Conformação Cromossômica (3C)

Identification of the Chromosome Conformation Capture (3C) Products

Take the chromosome confirmation capture or 3C sample and controls, and perform QPCR. Excise the product bands corresponding to the expected fragment size. To perform gel extraction of the PCR products, use a commercial kit or follow the homemade protocol.For the latter, construct a homemade purification cartridge by poking a hole in the bottom of a 0.5 milliliter tube with a needle. Pack a small amount of cotton into the bottom of the tube with the hole, filling no more than half of the tube. Place the tube into a 1.5 milliliter tube, ensuring that the smaller tube rests on the lip of the bigger tube, and not in the tube.Carefully cut the gel fragment into smaller pieces, and place it in the small tube of the cartridge. Place the assembly in a minus 20 degrees Celsius freezer for five minutes. Then, spin the assembly for three minutes at 13, 000 G and room temperature.Discard the small tube containing the agoros debris, and keep the 1.5 milliliter tube with the extracted DNA in the buffer. The samples were tested for the presence of long range chromatin contacts between the different genomic loci, using combinations of loci-specific primers and QPCR. The product abundance is relative to a control primer set were calculated and graft for comparison.The data indicated that 8 of the 10 reactions were conditional positives. Gel purification and sequencing of the expected PCR product for the eight conditional positives and one negative reaction were gel purified and sequenced. The results for representative positive and negative reactions are shown.