Previamente à coloração por imunofluorescência multiplex, fixar o tecido e realizar a desparafinização e inibição da peroxidase endógena. Em seguida, para coloração por imunofluorescência multiplex, submergiram as lâminas em um frasco de coloração de 300 mililitros contendo tampão citrato de 10 milimolares complementado com Triton X-100 a 0,1%. Coloque o frasco de coloração com a tampa fechada no micro-ondas por três a cinco minutos na potência máxima até que o tampão comece a ferver.
Após a fervura, deixe o tampão em temperatura próxima à ebulição, colocando o micro-ondas em baixa potência por 15 minutos. Novamente, aqueça o tampão colocando o micro-ondas na potência máxima por 90 segundos. Retire o frasco do micro-ondas e deixe o tampão esfriar por 15 minutos em temperatura ambiente.
Enxaguar as lâminas três vezes por cinco minutos cada em água destilada, seguido de cinco minutos de enxágue em solução salina tamponada com Tris contendo Tween 20 a 0,1% ou TBS Tween. Após a última lavagem, remova a TBS Tween borrando as lâminas em um papel toalha. Em seguida, coloque as lâminas em uma caixa de lâminas do microscópio e circunde o tecido com uma caneta hidrofóbica.
Bloquear os sítios de ligação inespecíficos cobrindo o tecido com BSA a 5% dissolvido em TBS Tween. Após 30 minutos, remova o buffer de bloqueio borrando as lâminas em um papel toalha. Em seguida, incubar o tecido por 60 minutos com 300 microlitros de anticorpo primário diluídos em BSA 1%, TBS Tween.
Após a incubação, enxaguar as lâminas três vezes por três minutos cada com TBS Tween. Após a lavagem, incubar o tecido por 40 minutos com 300 microlitros de anticorpo secundário Poly-HRP. Após a incubação, enxaguar as lâminas três vezes por três minutos cada com TBS Tween.
Em seguida, incubar o tecido por 10 minutos com 300 microlitros de reagente fluorocromo tiramida diluídos 200 vezes em tampão borato suplementado extemporaneamente com peróxido de hidrogênio a 0,003%. Em seguida, enxaguar as lâminas três vezes com TBS Tween e incubar o tecido durante a noite a quatro graus Celsius com anticorpo pan-citoqueratina humano diluído em 1% BSA, TBS Tween. No dia seguinte, enxaguar o tecido com TBS Tween e incubar por 120 minutos com o anticorpo secundário diretamente acoplado ao fluorocromo diluído 200 vezes em BSA 1%, TBS Tween.
Após a incubação, enxaguar o tecido com TBS Tween antes de corar os núcleos com bisBenzimida diluída 1.000 vezes em BSA 10%, TBS Tween por cinco minutos. Enxaguar o tecido três vezes por três minutos cada em água destilada antes de montá-lo em uma lâmina usando um meio de montagem de fluorescência e vidro de cobertura de borossilicato. Para análise de imagem, importe as digitalizações para um software de análise de imagem.
Em seguida, vá para a guia Análise e selecione o algoritmo de fluorescência high-plex clicando em Configurações, Ações e, em seguida, em Carregar. Selecione a guia Seleção de corante e o corante de interesse. Na guia Detecção Nuclear, vá para Tipo de Segmentação Nuclear e selecione AI Custom.
Em seguida, no Classificador de Segmentação Nuclear, selecione o AI.In treinado salvo na guia Detecção de Membrana e Citoplasma, escolha o raio máximo do citoplasma e o número de corantes de membrana. Para cada corante, selecione o limiar positivo para núcleo, o limiar positivo para citoplasma e o limiar positivo para membrana. Para cada corante, selecione os valores de completude do núcleo, membrana e citoplasma.
Salve o algoritmo selecionando Configurações, Ações e Salvar. Analise a região de interesse clicando em Analisar e selecionando Camada de Anotação. Em seguida, vá para a guia Resultados e selecione todos os dados em Dados do objeto.
Exporte os dados em formato CSV clicando com o botão direito do mouse em Exportar e selecionando objectdata.csv. Um resultado representativo da coloração ótima por imunofluorescência multiplex é mostrado. A escolha da diluição correta foi essencial para verificar a especificidade dos anticorpos e otimizar a relação sinal-ruído da coloração.
