Comece misturando 200 microlitros de soro reduzido com dois microgramas de qualquer DNA plasmidial separadamente em um tubo de microcentrífuga estéril. Repita isso para dois outros plasmídeos em tubos separados. Em seguida, no novo tubo dois, misturar 200 microlitros de soro reduzido com seis microlitros de reagente de transfecção e misturar o conteúdo por pipetagem.
Incubar os tubos durante cinco minutos à temperatura ambiente antes de misturar o conteúdo do tubo dois ao tubo um. Em tubos separados, repita a mistura dos outros dois plasmídeos com um reagente de transfecção. Incubar a mistura durante 20 minutos à temperatura ambiente.
Em seguida, em gota, adicione os complexos de transfecção aos pratos de imagem com sementes de cultura de células HeLa, garantindo uma distribuição igual em todo o prato. Uma hora antes da aquisição de imagens, abra a válvula do tanque de dióxido de carbono e ligue o controlador ambiental para o microscópio. Usando as setas para cima e para baixo no touch pad, ajuste a temperatura para 37 graus Celsius e o dióxido de carbono para 5%Pressione Set quando terminar.
Para ajustar as configurações do laser, ligue o laser de luz branca clicando na guia Adquirir e selecionando Abrir Visão Geral do Laser. Na caixa de diálogo, ative o laser de luz branca. Digite a potência do laser como 85%Clique no botão de controle de excitação e selecione a potência máxima no menu suspenso.
Comece o percolato de éster etílico tetraetil rodamina ou TMRE, experimente definindo o laser de excitação para 514 nanômetros e a janela de espectros de emissão para 524 a 545 nanômetros para YFP. Em seguida, para o MitoTracker Deep Red, defina o laser de excitação para 641 e a janela de espectros de emissão para 650 a 750 nanômetros. Da mesma forma, para TMRE, defina o laser de excitação para 555 nanômetros e a janela de espectros de emissão para 557 a 643 nanômetros.
Inicie a configuração de aquisição de imagem selecionando a guia Aquisição e ajustando o formato para 1024 por 1024. Ajuste a velocidade para 600 no menu suspenso. Em seguida, clique no botão Média de linhas e, no menu suspenso, selecione três.
Ative a varredura bidirecional e defina o fator de fase e zoom para 22,61 e 1,50, respectivamente. Uma vez feito, selecione as células com base no sinal fluorescente YFP clicando na configuração YFP um e pressionando Fast Live. Em seguida, ajuste o ganho e a intensidade do YFP e, em seguida, selecione as células com base no sinal fluorescente YFP.
Para obter imagens da placa de controle DMSO no experimento TMRE, ajuste o ganho e a intensidade do sinal TMRE definindo dois para que a intensidade da rede mitocondrial esteja um pouco abaixo da saturação. Mantenha o ganho e a intensidade para TMRE constantes. Em seguida, ajuste o ganho e a intensidade da configuração do MitoTracker para que a rede mitocondrial fique visível, mas fraca.
Quando as configurações de ganho e intensidade estiverem concluídas, clique em Iniciar para adquirir uma imagem. Adquirir imagens de 20 células por condição experimental.
