Após a fixação do globo ocular enucleado do camundongo eutanasiado, transfira-o para uma lâmina de vidro e coloque-o sob um microscópio dissecante. Usando pinças, prenda a margem da córnea para evitar o movimento do globo ocular. Com a tesoura dissecante, corte ao redor da córnea a uma profundidade de aproximadamente um milímetro através do limbo escleral da córnea e, em seguida, remova o cristalino e o corpo vítreo.
Segurando o disco óptico no centro, corte a retina radialmente ao longo dos quatro quadrantes, atingindo aproximadamente 2/3 do raio da retina. Aperte uma das bordas esclerais usando pinça dentada. Segure a borda da esclera com pinças não dentadas e mova-se da pinça dentada em direção à base da esclera.
Descasque cuidadosamente a retina. Molhe a retina com 200 microlitros de PBS usando uma pipeta. Remova o excesso de PBS usando papel absorvente e achate a retina com uma pequena escova de cerdas, se necessário.
Adicione lentamente metanol frio gota a gota na superfície interna da retina até cobrir completamente. Uma vez que a retina fica branca e desenvolve maior tenacidade, achate suavemente a retina e remova impurezas, como membranas pigmentares residuais e o corpo vítreo, com uma pequena escova de cerdas. Depois de inverter a retina, trate-a com metanol, como demonstrado anteriormente, e transfira-a para um poço de placa de 24 poços, mergulhe-a em metanol e armazene-a a 20 graus Celsius por uma a duas horas para imunomarcação imediata.
Em seguida, lave a retina com PBS depois de remover o metanol da placa. As células ganglionares de retinol das retinas antes e após o tratamento com metanol foram visualizadas por microscopia confocal, indicando que os 12 meses de preservação do metanol não afetaram a imunomarcação RGC.
