Comece colocando um rato grávida sacrificado de costas em uma placa de dissecação. Usando pinças, pinça a linha média abdominal. Com uma tesoura afiada, corte o abdômen através da pele e do peritônio da genitália até a caixa torácica sobre a linha média.
Retire o útero que contém os embriões e coloque-o imediatamente no gelo. Corte cuidadosamente o saco vitelínico nas laterais placentárias e remova os embriões. Em seguida, coloque as cabeças embrionárias decapitadas em um prato gelado contendo HBSS deficiente em cálcio e magnésio.
Coloque a cabeça em um prato de 35 milímetros voltado para a esquerda. Perfure um olho com a borda da pinça, segurando firmemente o queixo com o outro. Rasgue suavemente a pele do couro cabeludo da nuca ao longo da linha média em direção ao focinho.
Use a pinça angulada para entrar pela medula espinhal oval branca e abrir o crânio ao longo da linha média, expondo o cérebro. Descasque suavemente o crânio para longe dos lados. Em seguida, levante o cérebro para fora do crânio e elimine o crânio.
Use fórceps para remover as meninges. Coloque os cérebros em um bijou contendo dois mililitros de HBSS deficiente em cálcio e magnésio. Adicione 250 microlitros de tripsina 10X ao bijuteria.
Triture os cérebros agitando o bijou e incube por 15 minutos a 37 graus Celsius. Em seguida, adicione dois mililitros de inibidor de tripsina de soja a cada bijuteria. Agite para dispersar o inibidor uniformemente.
Sem centrifugar, transfira dois mililitros do sobrenadante de cada bijou para um tubo de centrífuga de 15 mililitros. Usando uma agulha de calibre 19 acoplada a uma seringa de cinco mililitros, aspirar a suspensão duas vezes para triturar as células restantes no bijuteria. Repetir a aspiração duas vezes com uma agulha de calibre 21.
Usando uma agulha de 23 G, transfira as células do biju para o tubo de centrífuga de 15 mililitros contendo o sobrenadante celular e centrífuga a 200 G por cinco minutos à temperatura ambiente. Usando uma pipeta sorológica de cinco milímetros, transfira todo o sobrenadante para um novo tubo de centrífuga de 15 mililitros sem perturbar o pellet. Repita a centrifugação.
Adicione 10 mililitros do meio de chapeamento a um tubo contendo os pellets combinados de ambas as etapas de centrifugação e misture bem para criar uma suspensão inteira. Colorir as células com azul de tripano e contar usando um hemocitômetro ou um contador de células. Plaquear as células adicionando o volume necessário da suspensão de células cerebrais embrionárias E17 murinas em uma placa de poço.
Incubar as células a 37 graus Celsius sob 5 a 7% de dióxido de carbono por duas a quatro horas. Depois de remover a mídia, adicione novas mídias de diferenciação a cada poço. Pressione qualquer tampa flutuante usando uma ponta de pipeta estéril.
Manter as culturas removendo parte do sobrenadante e substituindo-o por meios de diferenciação frescos três vezes por semana. As culturas foram visualizadas pela coloração de imunofluorescência para NG2 e nestina como marcadores de desenvolvimento, SMI31, MBP e NeuN como marcadores neuronais, e CNP, GFAP e Iba1 como marcadores gliais A infecção das culturas com o vírus neurotrópico Semliki Forest afetou os oligodendrócitos e os neurônios. Investigações de qRT-PCR das células infectadas demonstraram upregulation do mRNA quimiotáxico da citocina Ccl5 em culturas tratadas com interferon beta.
Estudos de ELISA mostraram aumento de Ccl5 no sobrenadante, mostrando assim uma correlação entre o RNAm e a expressão de proteínas. Estudos por citometria de fluxo de suspensão unicelular mostraram que 70% das células permaneceram viáveis. Um grande número de micróglias, neurônios e astrócitos estavam presentes, enquanto oligodendrócitos foram os menos abundantes.
