Para infectar cotilédones de soja com Agrobacterium rhizogenes, planejamos primers para detectar o gene do plasmídeo de TI virD2 usando a sequência do plasmídeo Agrobacterium rhizogenes PRI2659 plasmídeo. Após a transformação, testar as colônias de Agrobacterium para a retenção de virD2 por PCR usando um kit de PCR. Depois de selecionar as colônias de Agrobacterium rhizogenes contendo tanto virD2 quanto o gene de interesse, coloque algumas colônias nas placas LB contendo 100 miligramas por litro de espectinomicina para o plasmídeo de interesse.
No dia seguinte, usando uma ponta de pipeta P200, raspe um comprimento de 1,5 centímetro da Agrobacterium da placa LB e ressuspenda-a em um mililitro de tampão fosfato. Diluir a suspensão celular ressuspensa e água ultrapura esterilizada em acetoringona. Meça a absorbância usando um tubo de cubeta a uma densidade óptica de 600 nanômetros.
Em seguida, em um gabinete de biossegurança, mergulhe um bisturi esterilizado na solução de Agrobacterium e faça um corte de um milímetro de profundidade ao longo da superfície interna do cotilédone. Coloque de seis a oito cotilédones cortados lateralmente sobre uma placa de Petri contendo papel de filtro saturado com germinação e meio de cultivo com acetoseringona. Incubar as placas à temperatura ambiente durante três dias sob um período fotográfico de 16 horas.
Após três dias, transferir os cotilédones infectados para o crescimento da raiz pilosa, ou placas de HRG. Incubar as placas nas câmaras de crescimento reguladas a 22 graus Celsius e uma intensidade de luz de 100 micromoles em um fotoperíodo de 16 horas até que raízes primárias com raízes secundárias de dois a três centímetros de comprimento sejam observadas. Após três a quatro semanas, colher raízes primárias que crescem do calo e contêm raízes secundárias usando bisturi estéril e pinças.
Transfira as raízes para placas de HRG de seleção contendo antibióticos apropriados e deixe-as crescer por mais cinco dias. No quinto dia, colher raízes pilosas transgênicas com raízes secundárias de três a seis centímetros de comprimento. Se observar proteínas fluorescentes, certifique-se de que as raízes secundárias tenham pouca autofluorescência.
Em seguida, para realizar elicitores ou tratamentos químicos, corte as raízes secundárias em pedaços de um centímetro e coloque aproximadamente 100 miligramas em ágar HRG em uma pilha. Em seguida, saturar a pilha com 80 microlitros da solução de tratamento apropriada e deixar a placa incubar à temperatura ambiente. Após 24 horas, para extração de RNA, seque rapidamente as raízes em um papel toalha esterilizado e colete-as diretamente em um tubo de microcentrífuga de dois mililitros.
Sele imediatamente a parte superior do tubo usando parafilme e faça dois pequenos furos usando pinças pontiagudas. Os resultados da PCR da colônia da Agrobacterium transformada são mostrados. As colônias positivas na PCR indicaram o gene de interesse.
No entanto, um terço a metade das colônias foram negativas para a pesquisa do gene virD2. A microscopia de fluorescência demonstra a localização subcelular da GFP-GmJAZ1-6. A análise da expressão gênica confirmou a superexpressão do fator de transcrição GmHSF6-1 da gliceolina e o silenciamento de RNAi de GmMYB2912 em raízes de Williams 82 harry.
