Para começar, inocular Limosilactobacillus reuteri DSM20016 do estoque de glicerol em seis mililitros de caldo De Man, Rogosa, Sharpe ou MRS, em um tubo de 50 mililitros. Incubar a cultura aerobicamente durante a noite a 37 graus Celsius em uma incubadora estática. No dia seguinte, inocular quatro mililitros da cultura noturna em 200 mililitros de caldo MRS.
Permitir que a cultura cresça aerobicamente em uma incubadora estática de 37 graus Celsius até que a densidade óptica a 600 nanômetros atinja 0,5 a 0,85. Em seguida, decante a cultura em tubos de centrífuga de 50 mililitros e coloque-os no gelo enquanto equilibra os tubos. Centrifugar a cultura em centrífuga pré-refrigerada e descartar o sobrenadante.
Antes de ressuspender o pellet em 50 mililitros de água bidestilada pré-resfriada, repita a centrifugação duas vezes. Após a última centrifugação, ressuspender o pellet em 25 mililitros de água bidestilada, sacarose 0,5 molar e glicerol a 10%. Centrifugar a suspensão celular, descartar o sobrenadante e ressuspender o pellet em dois mililitros de água bidestilada, sacarose 0,5 molar e glicerol 10% sobre gelo.
Aliquot a suspensão em porções de 50 a 100 microlitros em tubos de microcentrífuga pré-resfriados e armazene os tubos a menos 80 graus Celsius para uso posterior. Em seguida, para eletroporação, descongelar uma alíquota de células eletrocompetentes no gelo. Misture de cinco a 10 microlitros do plasmídeo na alíquota descongelada evitando ao máximo a pipetagem.
Transfira a mistura para uma cubeta de eletroporação de um mililitro gelada e eletroporato a 1,25 quilovolts, 400 ohms e 25 microfarads. Após a eletroporação, adicione um mililitro de caldo MRS e misture invertendo a cubeta uma ou duas vezes. Coloque as cubetas em uma incubadora estática de 37 graus Celsius por 2,5 a três horas para recuperação.
Em seguida, coloque toda a suspensão em várias placas de trado MRS com seleção apropriada. Coloque as placas dentro de um recipiente hermético com uma pequena vela acesa em uma atmosfera anaeróbica gerando sachê. Cresça a 37 graus Celsius por dois a três dias ou até que surjam colônias visíveis.
A eletroporação de L.reuteri com mCherry2 constitutivo produzindo plasmídeo pTRKH3 fornece eficiências de transformação de aproximadamente cinco a oito colônias por 200 microlitros plaqueados, independentemente da condição de metilação do plasmídeo. A transformação com pNZ123 não carregando nenhuma proteína repórter constitutiva exógena produziu eficiências de transformação de três vezes 10 para as quatro UFC por micrograma de DNA.
