Inocular L.reuteri em 10 mililitros de caldo MRS contendo um antibiótico apropriado e incubar durante a noite aerobicamente a 37 graus Celsius. No dia seguinte, centrifugar a cultura em centrífuga pré-resfriada Descarte o sobrenadante e lave o pellet em dois mililitros de buffer P1 padrão Centrifuge novamente e descarte o sobrenadante antes de ressuspender o pellet em 250 microlitros de tampão P1 modificado. Incubar por uma a duas horas a 37 graus Celsius.
Em seguida, adicione 250 microlitros de tampão P2 e misture invertendo de quatro a seis vezes. Após cinco minutos, adicione 350 microlitros de tampão N3 e misture invertendo o tubo. Centrifugar a 10.000 G por 10 minutos e transferir o máximo de sobrenadante possível para uma coluna de spin.
Centrifugar novamente por 60 segundos e descartar o fluxo. Lave a coluna de spin com 500 microlitros de PB tampão e centrífuga, descartando o flow-through. Lave a coluna de spin com 750 microlitros de PE tampão e centrífuga a 10.000 G por 60 segundos.
Descarte o fluxo e centrifuga novamente por 60 segundos para remover qualquer buffer residual. Coloque a coluna de spin em um tubo de microcentrífuga de 1,5 mililitro. Adicione 20 a 30 microlitros de água bidestilada sem Dnase e RNase ao filtro da coluna de spin e deixe por um a dois minutos antes de centrifugar a 10.000 G por 60 segundos.
Realizar uma reação de PCR padrão usando primers plasmidiais específicos com eluato fornecendo o DNA do molde, incluindo um controle positivo com um plasmídeo derivado da mini-preparação de E.coli. Executar o eluato de mini-preparação através de um gel de agarose resulta em uma mancha, em vez de bandas observáveis. No entanto, a PCR subsequente usando o eluato como um molde de DNA produz tamanhos de banda esperados.
