Para realizar o Protocolo de Ensaio de Cisalhamento de Célula Única, utilize o arranjo de aparelho de cisalhamento pré-montado que consiste em uma câmara de fluxo microfluídica encaixada colocada em uma placa de Petri contendo as células de interesse. Coloque toda a configuração em um microscópio invertido com objetiva alta o suficiente e um monitor de exibição. Focalizar a objetiva do microscópio, garantindo contraste adequado e bordas celulares distintas.
Mova o estágio do microscópio para garantir que as células sejam claramente visíveis no monitor de exibição e sejam imagens ao vivo. Selecione uma célula ou várias células distintas dentro da imagem ou do caminho de fluxo da câmara de fluxo ajustada e da placa de Petri. Para manter um fluxo contínuo e uniforme de meios viscosos, selecione taxas de infusão e retirada semelhantes.
Garantir o fluxo laminar adequado do fluido com o número de Reynold ou RE inferior a 100. Clique em Executar na bomba de cisalhamento para injetar e retirar o fluido de cisalhamento a uma taxa contínua. Certifique-se de que não há bolhas durante a infusão de fluidos.
Comece a gravar um vídeo clicando em Gravar no software antes que o fluido de cisalhamento infundido entre em contato com a célula de interesse sob o microscópio. Continue a gravar por sete minutos ou pela duração desejada da exposição ao estresse ou até que a célula de interesse se desfaça do fundo do prato. Clique em Parar gravação no software do microscópio quando a execução for concluída conforme desejado.
O software salva automaticamente as imagens e vídeos que podem ser coletados usando unidades flash para análise posterior. Extraia as imagens como arquivos TIFF, de preferência a um quadro por segundo para facilitar a análise.
