Este método permitirá aos pesquisadores avaliar a viabilidade celular independentemente da função mitocondrial. E é aceitável para altos esforços de triagem de drogas. Esta técnica é rápida, precisa, barata, e permite a determinação de compostos citotoxicidade, incluindo aqueles que prejudicam a função mitocondrial na maioria dos tipos de células.
Este protocolo é fácil de executar. É importante prestar atenção à preparação da droga, às condições de tratamento e à densidade celular para garantir a precisão e validade experimentais. A demonstração visual desse método é importante porque as etapas de aquisição de imagens e análise de imagens podem ser difíceis de recapitular, especialmente para pesquisadores que têm pouca experiência com o Software Gen5.
Comece preparando soluções dos compostos de interesse na concentração desejada. Certifique-se sempre de misturar compostos com vórtice completamente. Para medir a citotoxicidade de um único composto, prepare os compostos na concentração final de 2X.
Se medir a citotoxicidade das combinações compostas, prepare-as em uma concentração final de 4X. Prepare os controles somente do solvente misturando a mesma quantidade de solvente com o meio apropriado. Colete células em um tubo cônico de 15 mililitros e alíquotas de 10 microliters da suspensão celular.
Para coloração azul trypan, adicione 10 microlitadores de 0,4% de azul trypan à alíquota e use um hemócitometro ou contador celular para contar células viáveis e não viáveis. Células de pelotas no tubo de 15 mililitros a 200 vezes G por cinco minutos, depois aspiram ou descamparam o supernante. Suspendemos a pelota celular em ensaios de mídia apropriada a uma densidade celular de três vezes 10 a cinco células por mililitro.
Use uma pipeta multicanal para semear 50 microliters de suspensão celular em cada poço de uma placa de poço 96. Para ensaios compostos únicos, adicione 50 microliters de solução composta 2X em cada poço. Para poços de controle de solventes, adicione 15 microliters de mídia de teste contendo o solvente na concentração de 2X.
Para ensaios de combinação, adicione 25 microliters de cada um dos compostos 4X em cada poço. Para poços de controle composto único, adicione 25 microliters cada uma da solução composta 4X e meio de teste. Certifique-se de que a concentração final de DMSO não exceda 0,5% Para garantir a reprodutibilidade, adicione medicamentos com as pontas da pipeta tocando o lado dos poços.
Ter cuidado para adicionar as drogas a diferentes locais. Estas facadas devem ser realizadas muito rapidamente, de preferência levando não mais do que 30 minutos por placa. Bata suavemente na placa para misturar o conteúdo dos poços e incuba-lo a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono.
Quando estiver pronto para colorar as células com Hoechst 33342 e iodeto de propidium prepare uma solução de coloração 10X fresca e adicione 10 microliters a cada poço. Bata suavemente na placa e incuba-a a 37 graus Celsius por 15 minutos. Centrifugar a placa a 200 vezes G por quatro minutos para trazer todas as células para o fundo da placa.
Em seguida, limpe cuidadosamente o fundo da placa com uma limpeza de laboratório úmida para remover quaisquer detritos que possam interferir com a imagem. Imagem da placa dentro de 15 minutos após a centrifugação. Abra o Software Gen5 e crie um novo protocolo padrão, clique em Procedimento e escolha o tipo de placas a serem usadas.
Normalmente, 96 placas de plástico bem pretas. Em seguida, defina o método de leitura para imagem, clique em Ok e escolha conjuntos de filtros vermelhos daPI e Texas com um objetivo de ampliação 4X. Não é necessário compensação, já que os centros do poço serão imagens.
Para o filtro DAPI, defina LED para 10, tempo de integração para 99 e ganhe a zero. Para o Texas Red, defina o LED para oito, o tempo de integração para 950 e o ganho para 18. Clique em Opções para garantir que o foco automático seja realizado no canal DAPI e não haja compensação no foco entre os canais.
Salve o protocolo clicando em Ok. Agora, as imagens podem ser gravadas usando o botão Ler Novo. Uma vez que as imagens são gravadas, clique em Redução de Dados e escolha Pré-processamento de imagem.
Aplique pré-processamento de imagem com subtração de fundo escuro usando tamanho de achatamento automático com base no sinal DAPI. Para o Texas Red, use as mesmas opções do Canal 1. Quando terminar, clique em Ok.
Em seguida, vá para o painel de análise celular e aplique uma Máscara Nuclear com base no sinal DAPI transformado com um valor limiar de 6.000 unidades, tamanho mínimo do objeto de cinco micrômetros e tamanho máximo do objeto de 25 micrômetros. Analise toda a imagem, exclua objetos de borda primária na borda da imagem e divida objetos de toque. Em opções avançadas de detecção, defina o diâmetro da bola rolando como 30 micrômetros e avalie o fundo com base em 5% dos pixels mais baixos.
Só mantenha a contagem de células em métricas calculadas. Depois disso, realize uma análise de subpopulação baseada no sinal vermelho do Texas transformado médio com um valor limiar de 5.000 unidades para contar células mortas. Finalmente, acesse a contagem de células resultantes.
Imagens representativas de células manchadas com Hoechst, iodeto de propidium são mostradas aqui. O número total de células é razoavelmente alto e maior do que o número de células mortas. Quando um painel de ensaios de citotoxicidade foi comparado com a exclusão azul trypan, descobriu-se que mtt e o azul Alamar ensaios imprecisamente medido viabilidade celular.
Esses ensaios baseados em enzimas mitocondriais mostraram viabilidade significativamente menor em comparação com a exclusão azul trypan. A coloração dupla com Hoechst 33342 e PI teve a melhor combinação de robustez, sensibilidade e consistência com coloração azul trypan e o menor desvio mediano do método de exclusão azul trypan após o tratamento CCP ou 2-DG. O ensaio de Hoechst PI também foi eficaz na determinação da viabilidade celular após o tratamento com as mitocôndrias que visam moléculas Rotenone e três bromopyruvate.
Foi validado ainda com um painel de linhas celulares de leucemia. Essas células variaram na sensibilidade rotenone que variava de células de resistência muito sensíveis. O desempenho inadequado do ensaio pode comprometer sua precisão.
Vários resultados comprometidos são mostrados aqui. A sobretensão com pi, negligenciando a etapa de centrifugação, ou superexposição no canal Hoechst, causará resultados subótimos. Ao cronometrar este protocolo, lembre-se de otimizar a concentração de corante e o tempo de coloração para cada linha celular.
Além disso, a centrificação para uma placa de amostra é necessária para garantir a qualidade da imagem. Após a identificação de compostos de efeito citotoxicidade nas células cancerosas, os pesquisadores podem proceder com estudos mecanicistas para identificar seus alvos relevantes. A triagem de pequenas moléculas bibliotecas com essa técnica em paralelo aos ensaios convencionais de MTT permitirá que moléculas que visam a função mitocondrial sejam rapidamente identificadas.
