Para começar, mantenha as células em um frasco de cultura de 75 centímetros quadrados. Aspirar o meio de cultura e enxaguar as células com PBS sem cálcio e magnésio. Em seguida, adicione dois mililitros de EDTA de tripsina a 0,25% para destacar as células de aderência.
Incubar por cinco minutos em temperatura ambiente e ressuspender as células em 10 mililitros de meio. Em seguida, recolher as células do frasco num tubo centrífugo de 15 mililitros. Centrifugar a 480 G durante cinco minutos à temperatura ambiente e aspirar o meio.
Ressuspender as células em 5 a 10 mililitros de meio com base na confluência original da cultura. Retire 100 microlitros de células e adicione a um tubo de 1,5 mililitro com 100 microlitros de azul de tripano a 0,4%. Adicione as células ao hemocitômetro e conte-as observando ao microscópio e usando o contador de contagem manual.
Diluir as células para três vezes 10 a quarta células por mililitro no meio de cultura sem vermelho fenol. Adicione 2,5 mililitros da suspensão celular a cada poço de uma placa de seis poços com tampa revestida de poli-D-lisina de acordo com as instruções do fabricante. Cultive as células durante a noite a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono em uma incubadora umidificada para permitir a fixação celular à tampa.
No dia seguinte, examine a fixação celular sob um microscópio invertido usando uma objetiva de 20X. Prepare as soluções-estoque de tratamento nas concentrações desejadas e crie um controle somente de meio, um controle somente de veículo em uma concentração que corresponda ao composto de teste e um controle com o ionóforo FCCP e os compostos de teste. Trabalhando com uma tampa de cada vez, adicione 1,8 mililitros de meio para a condição em estudo às células.
Incubar as células tratadas com o composto de controle ou de teste a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono em um ambiente umidificado pelo tempo desejado. Após o período de tratamento, adicionar 200 microlitros de 10X TMRE às células. Incubar durante 15 a 30 minutos a 37 graus Celsius num ambiente humidificado com 5% de dióxido de carbono.
Aspirar suavemente o meio e enxaguar as células duas vezes com PBS para minimizar a interferência de fundo. Em seguida, inverta a tampa para uma lâmina de microscópio rotulada com as condições de tratamento. Imagem das células vivem a 549 nanômetros de excitação e 575 nanômetros de emissão.
Utilize um microscópio confocal para capturar vários campos de pilha Z com captura de imagem de alta velocidade antes que a integridade da célula seja perdida. Salve e armazene o arquivo de imagem para análise posterior. As células com mitocôndrias ativas mantiveram a coloração TMRE e apresentaram alta fluorescência.
As mitocôndrias despolarizadas ou inativas têm potencial de membrana reduzido, não conseguem reter a TMRE e mostram um sinal de baixa fluorescência.
