Para começar, pegue a gota descongelada digital ou mistura mestre ddPCR e adicione sondas, primer para frente e primer reverso para ele à temperatura ambiente. Prepare a mistura mestre para cada alvo de amplificação seguindo a composição sugerida na tela e ajuste as concentrações de primers e sondas conforme necessário. Vórtice a mistura completamente e centrifuxe-a brevemente em uma mini centrífuga.
Adicione a enzima de restrição e inverta para misturar. Em seguida, adicione 16,5 microlitros da mistura mestre preparada a cada poço de uma placa de PCR e sele a placa com uma película adesiva transparente. Usando o tampão de diluição da amostra como diluente, prepare o controle de qualidade ou diluições de CQ conforme descrito nesta tabela, que representa as concentrações recomendadas para uma execução de precisão e exatidão de validação.
Diluir as amostras lacrimais com um tampão de diluição da amostra numa proporção de 1 para 10 em tubos de PCR de 0,2 mililitros e selar os tubos. Aqueça as amostras em um termociclador a 95 graus Celsius por 10 minutos e, em seguida, a 4 graus Celsius por pelo menos 5 minutos. Remova o filme adesivo da placa ddPCR que contém a mistura mestre e adicione 5,5 microlitros de diluição de QC aos poços apropriados da placa de 96 poços, conforme mostrado no mapa da placa.
Em seguida, adicione 5,5 microlitros de amostra aos poços. Adicione 5,5 microlitros de tampão de diluição de amostra ao controle sem molde ou poços NTC. Diluir o controle de tampão ddPCR 2x em uma proporção de 1 para 2 usando água livre de nuclease e adicionar 22 microlitros do tampão a quaisquer poços vazios de uma coluna.
Adicione um selo de folha perfurável à placa e coloque a placa no selador da placa. Sele a placa por 5 segundos a 180 graus Celsius. Vórtice a placa à velocidade máxima por pelo menos 30 segundos e centrifugue brevemente em um girador de placa.
Na tela sensível ao toque do Automated Droplet Generator, selecione as colunas no mapa da placa contendo as amostras. O convés do instrumento acenderá para indicar quais consumíveis são necessários. Carregue o gerador de gotículas de trás para frente.
A luz amarela mudará de amarelo para verde para indicar a suficiência dos consumíveis. Coloque um bloco frio e o suporte da placa de gotículas. Certifique-se de que o bloco é totalmente azul e nenhum rosa está visível.
Coloque uma nova placa ddPCR de solda 96 no bloco frio. Coloque a placa de PCR preparada no suporte da placa de amostra. Feche a tampa da máquina e pressione start para geração de gotículas.
Dentro de 30 minutos, remova a placa que contém as gotículas do bloco frio. Adicione um selo de folha perfurável à placa e coloque a placa no selador da placa. Selá-lo por cinco segundos a 180 graus Celsius.
Em seguida, coloque a placa em um termociclador compatível e insira as condições de ciclagem mostradas na tela. Coloque a placa no leitor de gotículas, garantindo que o óleo do leitor permaneça suficiente e que o recipiente de resíduos tenha espaço suficiente. Finalmente, pressione o botão de leitura no software para começar a ler as gotículas.
Uma média intraensaio para cada concentração em cada ensaio foi calculada e utilizada para avaliar a precisão e exatidão do ensaio. Uma precisão interensaio média de 7,7% e uma precisão interensaio absoluta média de 4,2% foram encontradas em todos os níveis de CQ. A exatidão e a precisão interensaios também foram calculadas usando a média interensaio de cada nível de CQ dentro de cada lote.
Encontrou-se precisão interensaio variando de 4 a 8,5% e acurácia absoluta interensaio variando de um a 3,2%. Da mesma forma, para a amostra lacrimal foi observada uma precisão média interensaio de 3,7% no nível alto da espícula e 12,2% no nível baixo da espícula e uma precisão absoluta média interensaio de 11,3% no nível alto e 8,1% no nível baixo. No caso do cálculo interensaios, encontrou-se precisão de 5,5% no nível alto e 7,1% no nível baixo e precisão absoluta de 11,3% no nível alto e 8,1% no nível baixo.
