Nosso protocolo quantifica vetores virais adenoassociados em matrizes complexas. A detecção e quantificação precisas são essenciais para avaliar seu desempenho em ensaios clínicos. Este protocolo visa especificamente preencher as lacunas regulamentares actuais na concepção de estudos moleculares compatíveis com as boas práticas de laboratório.

Como parte do desenvolvimento do vetor viral, as agências reguladoras exigem a avaliação da bio-eliminação do vetor. A ddPCR é uma tecnologia promissora para essa avaliação, pois permite quantificação precisa sem o uso de uma curva padrão e melhora da sensibilidade em relação à qPCR. A quantificação precisa nas matrizes complexas encontradas em ambientes clínicos, como lágrimas, pode ser difícil de validar devido à interferência e inibição da PCR.

Quantidades limitadas de amostras clínicas também podem limitar a capacidade de detectar eventos raros se o ensaio não for suficientemente sensível. Nossa abordagem desenvolve uma estrutura baseada em ddPCR repetível e adaptável para validar ensaios para uso em estudos regulamentados. Este método evita uma etapa específica de extração de DNA, permitindo uma validação mais simplificada e fornece critérios claros para avaliar o desempenho do ensaio para garantir robustez e repetibilidade.

Este protocolo tem o potencial de ser aplicado a qualquer estudo de excreção de vetor viral, não apenas à detecção de AAV em lágrimas, como apresentado aqui. Ele cria uma estrutura robusta e repetível sobre a qual vários programas regulamentados adequados à finalidade podem ser desenvolvidos.