Sample Preparation, RNA Extraction, PCR Clean Up, and Quantification for Whole Genome Sequencing of Rabies Virus (RABV)

Prepare dois tubos de contas de cerâmica enchendo um tubo de PCR de dois mililitros com um tubo de aproximadamente 200 microlitros cheio de contas de cerâmica de 1,4 milímetro e rotule o tubo de acordo antes de transferi-los para dentro do exaustor estéril. Adicione o volume recomendado de tampão de lise fornecido no kit de extração de RNA ao tubo de PCR marcado. Obtenha aproximadamente um cubo de três milímetros da amostra de cérebro confirmada com infecção por raiva usando um aplicador de madeira e coloque-o em um tubo rotulado com identificação da amostra e 100 microlitros de água livre de nuclease no tubo rotulado como controle negativo.

Interrompa o tecido cerebral manualmente usando um bastão aplicador de madeira e, em seguida, vórtice na velocidade máxima até que a homogeneização completa do tecido seja alcançada. Em seguida, centrifugar o lisado homogeneizado. Transfira o sobrenadante para um tubo de microcentrífuga recém-marcado usando uma pipeta e use-o para etapas adicionais de extração de RNA, preparação de CDNA e amplificação por PCR.

Após a preparação do CDNA e amplificação da PCR usando pools de primers A e B, realizar a limpeza e quantificação da PCR na área pós-PCR. Aliquot SPRI contas em micro tubos de centrífuga da garrafa principal. Estes também podem ser preparados com antecedência.

Guarde os tubos a quatro graus Celsius ou mantenha-os em uma prateleira fria ou gelo. Em seguida, aqueça a alíquota do talão SPRI a aproximadamente 20 graus Celsius e faça um vórtice completo para ressuspender as contas em toda a solução. Em seguida, nos tubos de 1,5 mililitro, combine os produtos de PCR do pool de primers A e do pool de primers B para cada amostra.

Adicione água para trazer o volume para 25 microlitros, se necessário, antes de adicionar 25 microlitros de contas SPRI a cada produto combinado e misturá-lo. Incubar a mistura à temperatura ambiente durante 10 minutos com inversão ou agitação ocasional dos tubos. Em seguida, coloque os tubos em um rack magnético até a separação das esferas e da solução.

Uma vez feito, descarte o sobrenadante sem perturbar o grânulo. Em seguida, faça duas lavagens de 30 segundos usando 200 microlitros de etanol 80% recém-preparado e descarte o etanol. Após a segunda lavagem, remova todos os vestígios de etanol usando uma ponteira de pipeta de 10 microlitros.

Seque o pellet ao ar até que o etanol tenha evaporado e o pellet mude de brilhante para fosco. Ressuspenda as esferas em 15 microlitros de água livre de nucleases para recuperar o produto de DNA limpo e incubar à temperatura ambiente por 10 minutos. Separe as esferas da solução em um rack magnético.

Depois de transferir o sobrenadante para um tubo fresco de 1,5 mililitro, prepare uma diluição de um a 10 de cada amostra em água livre de nucleases. Medir a concentração de DNA de cada amostra diluída com um fluorímetro altamente sensível e específico, seguindo as instruções do fabricante.