Inicie o priming e o carregamento da célula de fluxo de qualidade verificada invertendo a tampa do dispositivo de sequenciamento e deslizando a tampa da porta de escorvamento no sentido horário, visualizando a porta de escorvamento. Para remover bolhas de ar, ajuste uma pipeta P 1000 para 200 microlitros e insira a ponta da pipeta verticalmente na porta de escorvamento. Gire a roda até ver um pequeno volume entrando na ponta da pipeta.
Carregue 800 microlitros de mistura de priming de célula de fluxo pré-preparada na célula de fluxo através da porta de escorvamento para evitar a introdução de bolhas. Levante a tampa da porta de amostra e carregue 200 microlitros da mistura de escorvamento restante na célula de fluxo através da porta de escorvamento. Para garantir a mistura das esferas de carregamento, ressuspenda a mistura mestre da biblioteca por pipetagem e, dropwise, carregue 75 microlitros para a célula de fluxo através da porta de amostra.
Substitua a tampa da porta de amostra suavemente, garantindo que o bung entre na porta de amostra. Feche a porta de escorvamento e substitua a tampa do dispositivo de sequenciamento. Para chamadas de base ao vivo, use Rampart.
Use o ambiente Arctic RabV e trabalhe no diretório criado para a saída Rampart. Em seguida, digite o comando Rampart para navegar até os caminhos necessários. Primeiro, o protocolo de esquema específico Rampart e, na próxima base, chamado path, a pasta de saída mino fastq pass para a execução.
Abra uma janela do navegador e navegue até o host local 3000 na caixa URL. Aguarde até que dados suficientes sejam chamados para a base antes que os resultados apareçam na tela. Os três painéis superiores mostram gráficos de resumo para toda a execução.
O gráfico um mostra a profundidade de cobertura das leituras mapeadas para cada posição de código de barras por nucleotídeo no genoma de referência índice. O gráfico dois mostra leituras mapeadas de todos os códigos de barras ao longo do tempo, e o gráfico três mostra leituras mapeadas por código de barras. Os painéis inferiores mostram linhas de gráficos por código de barras.
A esquerda mostra a profundidade de cobertura das leituras mapeadas por posição do nucleotídeo no genoma de referência índice. A distribuição de comprimento das leituras mapeadas está no meio. A proporção de posições de nucleotídeos no genoma de referência índice obtendo cobertura de 10x, 100x e 1000x das leituras mapeadas ao longo do tempo é vista no canto direito.
Para atribuição de linhagem de sequências de consenso, use MadDog. Puxe o repositório MadDog do GitHub para garantir o trabalho com a versão mais recente. Crie uma pasta dentro do repositório MadDog local criado anteriormente.
Dentro da pasta, adicione o arquivo fastA que contém as sequências de consenso. Além disso, adicione um arquivo de metadados à pasta. Verifique se esse arquivo é um CSV com quatro colunas chamadas ID, país, ano e atribuição.
Puxe o repositório MadDog do GitHub para garantir o trabalho com a versão mais recente. Na interface da linha de comando, ative o ambiente conda com um comando conda activate MADDOG. Na interface da linha de comando, navegue até a pasta do repositório MadDog.
Primeiro, execute a atribuição de linhagem em sequências para verificar possíveis anormalidades e identificar se a execução da etapa de designação de linhagem mais longa é apropriada executando a atribuição sh. comando sh. Quando solicitado, digite Y para confirmar se o repositório foi retirado e está funcionando com a versão mais recente do MadDog.
Quando solicitado, digite o nome da pasta que contém o arquivo fastA dentro do repositório MadDog. Quando a atribuição de linhagem estiver concluída, verifique o arquivo de saída na pasta. Se a saída for conforme o esperado e várias sequências forem atribuídas à mesma linhagem, execute a designação de linhagem.
Ao executar a designação de linhagem, exclua o arquivo de saída de atribuição recém-criado. No terminal dentro da pasta do repositório MadDog, execute o comando sh designation.sh. Quando solicitado, digite Y para indicar que o repositório foi retirado e o trabalho está sendo feito com a versão mais atualizada do MadDog.
Quando solicitado, digite o nome da pasta dentro da pasta do repositório MadDog que contém o arquivo fastA e os metadados. A amostra para sequenciamento para interpretação do vírus da raiva RABV foi usada com sucesso em diferentes condições laboratoriais em países endêmicos como Tanzânia, Quênia, Nigéria e Filipinas. A chamada de base ao vivo usando Rampart mostrou a geração em tempo real de leituras e a cobertura percentual por amostra.
Um sistema de classificação e nomenclatura de linhagens, MadDog, usado para compilar e interpretar sequências RABV resultantes, mostrou a classificação de maior resolução de linhagens locais após a atribuição MadDog.
