Depois de isolar núcleos únicos de tecidos congelados de mamíferos, perfure cuidadosamente a folha redonda no cartucho do dissociador usando uma ponta de pipeta. Para facilitar a limpeza do gradiente de sacarose, remova 900 microlitros da suspensão de núcleos do cartucho e adicione-a a 500 microlitros de solução de almofada de sacarose ou SCS preparada em um tubo de dois mililitros. Misture bem pipetando até que a mistura fique homogênea.
Em seguida, segure o tubo em um ângulo e adicione cuidadosamente 1.400 microlitros de mistura SCS de suspensão de núcleos em um novo 500 microlitros de SCS, criando uma separação de fase claramente visível. Feche cuidadosamente o tubo e coloque-o novamente no gelo sem perturbar a separação de fases. Gire cuidadosamente os tubos a 13.000g por 15 minutos a quatro graus Celsius em uma centrífuga pré-resfriada.
Remova o sobrenadante sem perturbar a paleta e ressuspenda cuidadosamente a paleta em 50 microlitros de NSR gelado. Puxe as duas paletas da mesma amostra em um novo tubo de 1,5 mililitro. Adicione 900 microlitros de NSR gelado a um volume total de um mililitro e misture bem por pipetagem.
Centrifugar a amostra a 500g durante cinco minutos a quatro graus Celsius com uma centrífuga de rotor de balde oscilante. Retire o sobrenadante e ressuspenda o pellet em 100 microlitros de PBS. Para a contagem, diluir 10 microlitros de suspensão de núcleos em 20 microlitros de PBS.
Adicionar 25 microlitros de solução corante de iodeto de propídio a um poço de mistura da placa de contagem de contadores fluorescentes. Em seguida, adicione 25 microlitros de suspensão de núcleos diluídos e misture bem por pipetagem. Transfira 50 microlitros da amostra corada do poço de mistura para o poço de carregamento.
Carregue a placa de contagem no contador de células e inicie a contagem. Após a contagem, diluir as amostras com PBS até a concentração desejada para o sequenciamento do RNA de núcleo único. Usando o protocolo de isolamento de núcleos parcialmente automatizados, núcleos de boa qualidade foram obtidos sem sinais de blabbing, debris ou aglomeração.
Gráficos de violino representando a distribuição das contagens de genes, contagens de UMI e conteúdo mitocondrial em cada amostra são mostrados. Os tipos celulares esperados de cada tecido foram identificados, e todos os animais contribuíram para todos os agrupamentos, indicando baixa variabilidade técnica introduzida pelo protocolo. Além disso, proporções celulares, contagens de UMI e contagens gênicas foram comparáveis entre todas as três amostras por tipo de tecido.
