Os autores gostariam de agradecer a Filip Bochner, Marion Richardson, Petra Staeuble e Matthias Selhausen pelo fornecimento dos tecidos animais que foram analisados neste manuscrito. Também gostaríamos de agradecer a Petra Schwalie, Klas Hatje, Roland Schmucki e Martin Ebeling por seu apoio em bioinformática.

Todos os estudos em animais foram realizados com a aprovação da autoridade veterinária cantonal de Basel-Stadt em estrita conformidade com os regulamentos federais suíços sobre proteção animal ou com a aprovação do Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais em conformidade com a Lei Alemã de Bem-Estar Animal.
1. Preparação de tecidos e reagentes/instrumentos
<ol><li>Limpeza e preparação de instrumentos<ol><li>Limpe bancadas e pinças com etanol 70% e solução de descontaminação da RNase. Pré-resfriar as centrífugas a 4 °C.</li>
		<li>Pré-resfriar os cartuchos de isolamento de núcleos na geladeira a 4 °C por pelo menos 30 min.</li>
		<li>Inicie o dissociador robótico e ligue o resfriamento definindo o controle deslizante no canto superior direito da tela para esfriar e clicando nele para começar a esfriar para que o controle deslizante apareça laranja. Verifique se o frasco de reagente de armazenamento de núcleos (NSR) anexado e o frasco de tampão de isolamento de núcleos (NIB) têm líquido suficiente e estão devidamente resfriados.</li>
		<li>Prepare uma caixa de espuma de poliestireno cheia de gelo seco e pré-resfrie placas de Petri e lâminas de bisturi sobre gelo seco.</li>
	</ol></li>
	<li>Preparação do tampão<ol><li>Preparar a solução de almofada de sacarose 1,5 M (SCS) conforme mostrado na Tabela 1. Distribuir o SCS em alíquotas de 500 μL em tubos de DNase/RNase de 2 mL para obter quatro alíquotas de SCS de 500 μL por amostra. Mantenha as alíquotas no gelo até o uso posterior.</li>
		<li>Em caso de processamento de tecido cerebral, preparar uma solução de coloide de sílica a 18%, conforme descrito na Tabela 2, diluindo a solução estoque de coloide de sílica em NSR e adicionando inibidor de RNase. Preparar 3 mL de solução de sílica coloide a 18% por amostra e mantê-la congelada.</li>
	</ol></li>
</ol>2. Homogeneização tecidual e isolamento de núcleos
<ol><li>Retire a amostra do congelador a -80 °C e coloque-a imediatamente sobre gelo seco.</li>
	<li>Corte a amostra numa placa de Petri pré-arrefecida ou placa de metal sobre gelo seco com um bisturi pré-arrefecido numa peça de 15-50 mg (se ainda não tiver o tamanho certo). Certifique-se de cortar a amostra na direção correta para que a amostra ainda seja representativa das estruturas do órgão de interesse. NOTA: Com este protocolo, 15-50 mg é o tamanho ideal da amostra para extração nuclear. Para obter um bom rendimento após a limpeza, recomenda-se um tamanho de amostra de pelo menos 25 mg. Para amostras menores, estão disponíveis cartuchos especiais otimizados para processar pequenas entradas com o dissociador robótico. Cartuchos de isolamento de núcleos de entrada pequenos foram empregados para dissociar amostras de tecido pesando até 4 mg com rendimento suficiente para sequenciamento de RNA de núcleo único a jusante. Um exemplo de rendimento de núcleos usando o cartucho de baixa entrada do tecido hepático de rato é mostrado na Tabela 3.</li>
	<li>Retire o cartucho de isolamento de núcleos da geladeira, desembale-o, remova o moedor e pipete 15 μL de inibidor de RNase (40 U/μL) para o fundo do cartucho. NOTA: Durante a extração dos núcleos, o dissociador robótico adicionará NIB e NSR ao cartucho para um volume total de 3 mL (com o protocolo de extração de núcleos de baixo volume). Ao adicionar 15 μL de inibidor de RNase (40 U/μL) ao cartucho antes da extração, a suspensão terá a concentração desejada de inibidor de RNAse de 0,2 U/μL.</li>
	<li>Coloque a amostra de tecido no fundo do cartucho usando uma pinça. Não coloque a amostra exatamente no centro do cartucho para ter a eficiência ideal de ruptura.</li>
	<li>Selecione Executar um protocolo no instrumento e clique na opção Núcleos no canto superior esquerdo.<ol><li>No menu, selecione o protocolo de isolamento de núcleos de baixo volume e verifique se a velocidade de interrupção está definida como rápida clicando em Modificar. Carregue o cartucho no instrumento abrindo a porta e deslizando para fora do palco levantando o botão vermelho.</li>
		<li>Insira o cartucho no local designado, gire a trava do cartucho e deslize no palco até que o botão vermelho se encaixe. Feche a porta e inicie a extração de núcleos no instrumento clicando em Avançar. A corrida dura aproximadamente 7 min.</li>
	</ol></li>
	<li>Quando a corrida terminar, remova o cartucho do instrumento levantando o botão vermelho e puxando o palco. Coloque imediatamente o cartucho no gelo.</li>
	<li>Para todos os tecidos, exceto o cérebro, avance para o passo 3.1. Para amostras de cérebro, prossiga diretamente para a etapa 3.2.</li>
</ol>3. Limpeza dos núcleos
<ol><li>Limpeza do gradiente de sacarose NOTA: Para o tecido cerebral, ignore esta etapa e vá diretamente para a etapa 3.2. Todas as etapas de limpeza são realizadas no gelo, a fim de minimizar a degradação do RNA. Os tampões e tubos, bem como as centrífugas, precisam ser pré-resfriados. Todas as etapas de ressuspensão e mistura são realizadas apenas por pipetagem cuidadosa, pois o vórtice pode comprometer a qualidade e integridade dos núcleos.<ol><li>Perfure cuidadosamente a folha redonda no cartucho do dissociador com uma ponta de pipeta. NOTA: Após a dissociação, a suspensão de núcleos resultante tem um volume aproximado de 2 mL. Para facilitar a limpeza do gradiente de sacarose, divida a suspensão dos núcleos em duas alíquotas de 900 μL, resultando em um volume total de 1,8 mL de suspensão de núcleos sendo usado durante a limpeza.</li>
		<li>Remova a primeira alíquota de 900 μL da suspensão de núcleos do cartucho e adicione-a a uma alíquota de 500 μL SCS previamente preparada em um tubo de 2 mL. Misture bem pipetando até que a mistura fique homogênea.</li>
		<li>Remova a mistura de 1400 μL de suspensão de núcleos - SCS e coloque-a cuidadosamente em uma nova alíquota SCS de 500 μL, segurando o tubo em um ângulo e adicionando a mistura em gotas, criando uma separação de fase claramente visível (ver Figura 1A).</li>
		<li>Feche cuidadosamente o tubo e coloque-o novamente no gelo sem perturbar a separação de fases.</li>
		<li>Repetir os passos 3.1.2-3.1.4 com a segunda alíquota de suspensão de 900 μL e uma nova alíquota SCS para ter dois tubos de 2 ml por amostra com uma separação de fases claramente visível para centrifugação por gradiente.</li>
		<li>Adicione cuidadosamente os tubos a uma centrífuga pré-resfriada e gire a 13.000 x g por 15 min a 4 °C.</li>
		<li>Enquanto isso, prepare o NSR descrito na Tabela 4, adicionando o inibidor de RNase a uma alíquota de NSR. Preparar 1 mL de NSR por amostra. NOTA: Neste ponto, as esferas de gel reagente de expressão gênica de célula única podem ser removidas do freezer de -80 °C, permitindo que elas se equilibrem à temperatura ambiente (RT), e o oligo de interruptor de molde pode ser ressuspendido em buffer TE baixo.</li>
		<li>Após a centrifugação, remova o sobrenadante de ambos os tubos sem perturbar o pellet e ressuspenda cuidadosamente o pellet em 50 μL de NSR gelado, de acordo com a recomendação do fabricante. Agrupar os dois pellets da mesma amostra em um novo tubo de 1,5 mL e adicionar 900 μL de NSR gelado a um volume total de 1 mL. Misture bem por pipetagem.</li>
		<li>Centrifugar a amostra a 500 x g durante 5 min a 4 °C com uma centrífuga de rotor de balde oscilante. NOTA: É altamente recomendável usar um rotor de balde oscilante para minimizar a perda de núcleos, especialmente quando se espera que o rendimento dos núcleos seja baixo ou quando se inicia com pequenas quantidades de tecido.</li>
		<li>Enquanto isso, preparar 500 μL por amostra de 1x PBS (sem Ca2+ e Mg2+) com 0,04% de albumina de soro bovino (BSA) e 0,2 U/μL inibidor de RNase, conforme descrito na Tabela 5.</li>
		<li>Remover cuidadosamente o sobrenadante sem descartar o pellet e ressuspendê-lo em 100 μL de solução de PBS conforme preparado acima (1x PBS + 0,04% BSA + inibidor de RNase a 0,2 U/μL). NOTA: Para amostras de tecido pequenas, a concentração de núcleos pode ser baixa e, portanto, recomenda-se ressuspender o pellet em apenas 50 μL de solução de PBS para garantir concentrações suficientemente altas para o sequenciamento de RNA de núcleo único.</li>
		<li>Prossiga diretamente para a etapa 4.</li>
	</ol></li>
	<li>Limpeza do gradiente coloide de sílica NOTA: Para o tecido cerebral, um gradiente de sílica coloide é mais adequado do que um gradiente de sacarose para remover mielina e detritos da suspensão dos núcleos. Todas as etapas de limpeza são realizadas no gelo para minimizar a degradação do RNA. Os tampões e tubos, bem como as centrífugas, precisam ser pré-resfriados. Todas as etapas de ressuspensão e mistura são realizadas apenas por pipetagem cuidadosa, pois o vórtice pode comprometer a qualidade e integridade dos núcleos.<ol><li>Perfure cuidadosamente a folha redonda no cartucho do dissociador com uma ponta de pipeta.</li>
		<li>Retire a suspensão de núcleos do cartucho e adicione-a a um tubo de 5 mL.</li>
		<li>Centrifugar a 500 x g durante 5 min a 4 °C numa centrífuga pré-arrefecida.</li>
		<li>Remover cuidadosamente o sobrenadante sem perturbar o pellet e ressuspender o pellet em 1 mL de solução gelada de sílica coloide a 18%.</li>
		<li>Adicionar mais 2 mL de solução coloide de sílica a 18% para obter um volume total de 3 mL e misturar bem por pipetagem.</li>
		<li>Centrifugar a amostra a 700 x g durante 5 min a 4 °C num rotor de caçamba oscilante com o travão acionado.</li>
		<li>Enquanto isso, prepare o NSR descrito na Tabela 4 adicionando o inibidor de RNase a uma alíquota de NSR. Preparar 1 mL de NSR por amostra. NOTA: Neste ponto, as esferas de gel reagente de expressão gênica de célula única podem ser removidas do freezer de -80 °C, permitindo que ele se equilibre para RT e o oligo do interruptor do molde pode ser ressuspendido em buffer TE baixo.</li>
		<li>Retire cuidadosamente a amostra da centrífuga sem perturbar a camada de mielina que flutua no topo.</li>
		<li>Primeiro, remova a camada de mielina do topo e descarte; Em seguida, remova cuidadosamente todo o sobrenadante sem perturbar o pellet. NOTA: A camada de mielina pode ser facilmente removida envolvendo um lenço estéril sem fiapos em torno de uma ponta de pipeta de 1 mL para aspirar a camada de mielina juntamente com 1-2 mL do sobrenadante.</li>
		<li>Ressuspender o pellet em 1 mL de NSR gelado conforme recomendação do fabricante.</li>
		<li>Centrifugar a amostra a 500 x g durante 5 min a 4 °C numa centrífuga com rotor de balde oscilante. NOTA: É altamente recomendável usar um rotor de balde oscilante para minimizar a perda de núcleos, especialmente quando se espera que o rendimento dos núcleos seja baixo ou quando se inicia com pequenas quantidades de tecido.</li>
		<li>Enquanto isso, preparar 500 μL por amostra de 1x PBS (sem Ca2+ e Mg2+) com 0,04% de albumina de soro bovino (BSA) e 0,2 U/μL inibidor de RNase, conforme descrito na Tabela 5.</li>
		<li>Remover cuidadosamente o sobrenadante sem perturbar o pellet e ressuspender a amostra em 100 μL de solução de PBS conforme preparado acima (1x PBS + 0,04% BSA + inibidor de RNase a 0,2 U/μL). NOTA: Para amostras de tecido pequenas, a concentração de núcleos pode ser baixa e, portanto, recomenda-se ressuspender o pellet em apenas 50 μL de solução de PBS para garantir concentrações suficientemente altas para o sequenciamento de RNA de núcleo único.</li>
	</ol></li>
</ol>4. Contagem
<ol><li>Para cada amostra a contar, diluir 10 μL de suspensão de núcleos em 20 μL de solução de PBS para obter uma diluição de 1:3.</li>
	<li>Para a contagem, adicionar 25 μL de solução corante de iodeto de propídio (PI) a um poço de mistura da placa de contagem de contadores fluorescentes. Adicionar 25 μL da suspensão de núcleos diluídos e misturar bem por pipetagem. Transfira a amostra corada de 50 μL do poço de mistura para o poço de carregamento.</li>
	<li>Carregue a placa de contagem no contador de células e inicie a contagem. NOTA: A contagem de núcleos é retirada do canal fluorescente vermelho com um tempo de exposição de 700 ms. Este canal foi otimizado para obter uma contagem precisa de núcleos por comparação cruzada com contagem manual com uma câmara de Neubauer e coloração de azul de Trypan sob o microscópio. Em altas concentrações, os núcleos estão muito próximos, dificultando a separação entre os softwares. Neste caso, recomenda-se a recontagem da amostra numa diluição adequada. A integridade dos núcleos, bem como a limpeza, pode ser avaliada a partir da imagem de campo brilhante ou sob um microscópio.</li>
	<li>Diluir as amostras com PBS (1x PBS + 0,04% BSA + inibidor de RNase a 0,2 U/μL) até a concentração desejada para sequenciamento de RNA de núcleo único. NOTA: Concentrações entre 700-1.200 núcleos/μL são consideradas ideais para o sequenciamento de RNA de núcleo único. Concentrações celulares mais baixas, como 700 núcleos/μL, podem resultar em contaminação de fundo reduzida do RNA ambiente.</li>
</ol>5. Preparação da biblioteca
<ol><li>Realizar o sequenciamento de RNA de núcleo único com os reagentes de expressão gênica de célula única usando o protocolo do fabricante visando uma recuperação de núcleos de 8000-10.000 núcleos por amostra.</li>
</ol>6. Sequenciamento
<ol><li>Sequencie as bibliotecas com a profundidade de sequenciamento desejada com indexação dupla emparelhada, e as seguintes leituras de sequenciamento: Leia 1: 28 ciclos, i7 Índice: 10 ciclos, i5 Índice: 10 ciclos e Leia 2: 90 ciclos.</li>
</ol>

Isolamento e Perfil de Núcleos Únicos de Tecidos de Mamíferos Congelados

<ol>
	<li>Burja, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+Optimized+Tissue+Dissociation+Protocol+for+Single-Cell+RNA+Sequencing+Analysis+of+Fresh+and+Cultured+Human+Skin+Biopsies.">An Optimized Tissue Dissociation Protocol for Single-Cell RNA Sequencing Analysis of Fresh and Cultured Human Skin Biopsies.</a> Front Cell Dev Biol. 10, 872688 (2022).</li><li>Kimbley, L. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+optimized+methodologies+for+isolating+nuclei+from+esophageal+tissue.">Comparison of optimized methodologies for isolating nuclei from esophageal tissue.</a> Biotechniques. 72 (3), 104-109 (2022).</li><li>Maitra, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extraction+of+nuclei+from+archived+postmortem+tissues+for+single-nucleus+sequencing+applications.">Extraction of nuclei from archived postmortem tissues for single-nucleus sequencing applications.</a> Nature Protocols. 16 (6), 2788-2801 (2021).</li><li>Nadelmann, E. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+nuclei+from+mammalian+cells+and+tissues+for+single-nucleus+molecular+profiling.">Isolation of nuclei from mammalian cells and tissues for single-nucleus molecular profiling.</a> Current Protocols. 1 (5), e132 (2021).</li><li>Rousselle, T. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+optimized+protocol+for+single+nuclei+isolation+from+clinical+biopsies+for+RNA-seq.">An optimized protocol for single nuclei isolation from clinical biopsies for RNA-seq.</a> Scientific Reports. 12, 9851 (2022).</li><li>Slyper, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+single-cell+and+single-nucleus+RNA-Seq+toolbox+for+fresh+and+frozen+human+tumors.">A single-cell and single-nucleus RNA-Seq toolbox for fresh and frozen human tumors.</a> Nature Medicine. 26 (5), 792-802 (2020).</li><li>Leiz, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nuclei+isolation+from+adult+mouse+kidney+for+single-nucleus+RNA-sequencing.">Nuclei isolation from adult mouse kidney for single-nucleus RNA-sequencing.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. 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G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+protocol+for+single+nucleus+RNA-seq+from+frozen+skeletal+muscle.">A protocol for single nucleus RNA-seq from frozen skeletal muscle.</a> Life Science Alliance. 6 (5), e202201806 (2023).</li><li>Bakken, T. 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D., Theis, F. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Current+best+practices+in+single-cell+RNA-seq+analysis:+a+tutorial.">Current best practices in single-cell RNA-seq analysis: a tutorial.</a> Molecular Systems Biology. 15 (6), e8746 (2019).</li><li>Fleming, S. 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D., Behjati, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SoupX+removes+ambient+RNA+contamination+from+droplet-based+single-cell+RNA+sequencing+data.">SoupX removes ambient RNA contamination from droplet-based single-cell RNA sequencing data.</a> Gigascience. 9 (12), giaa151 (2020).</li></ol>

Todos os autores são/foram funcionários da F. Hoffmann-La Roche durante a realização do estudo.

Desenvolvemos um protocolo versátil e parcialmente automatizado para obter núcleos únicos de alta qualidade a partir de tecidos congelados de mamíferos e demonstramos o protocolo em cérebro de camundongo, rim de rato e tecido hepático e baço de cynomolgus.
Ao compararmos o desempenho desse protocolo com o de outros protocolos publicados para sequenciamento de RNA de núcleo único em tecido cerebral, renal, baço e hepático 6,7,20,24,25,26, observamos que conseguimos detectar um número semelhante de genes e contagens de UMI por núcleo e somos capazes de recuperar os tipos celulares esperados. Comparado aos métodos existentes, existem várias vantagens para este protocolo. Primeiro, o protocolo deste estudo automatiza a homogeneização tecidual e o isolamento de núcleos únicos. Isso é conseguido com o uso de um disruptor de tecido robótico21. Na maioria dos protocolos, o tecido é homogeneizado com homogeneizador Dounce para liberar núcleos únicos 3,20. Entretanto, observamos que essa etapa manual pode levar a uma variabilidade experimental no rendimento e integridade dos núcleos dependendo da quantidade de força exercida durante a homogeneização, comprometendo a reprodutibilidade dos experimentos. Aqui, utilizando-se um moedor de tecidos automatizado com ajustes fixos, obteve-se boa qualidade dos núcleos e rendimento com maior consistência ao longo dos experimentos. Além disso, automatizar essa etapa também reduz o tempo prático do protocolo (a etapa de ruptura do tecido leva aproximadamente 7 min), permitindo que o usuário se prepare para as etapas subsequentes. Em segundo lugar, o protocolo descrito neste estudo é versátil, ou seja, é compatível com diferentes tecidos de diferentes espécies. Isso nos permite evitar a otimização de protocolos demorados, por exemplo, para identificar tampões/detergentes de homogeneização para diferentes tecidos 2,5,6. Em terceiro lugar, esse protocolo não depende do acesso a um classificador de fluxo para obter núcleos limpos, tornando-o mais acessível para laboratórios que não possuem os equipamentos/conhecimentos necessários para a triagem de fluxo. Em vez disso, otimizamos a filtração baseada em gradiente de sacarose para remover a maioria dos detritos. No entanto, para o tecido cerebral em particular, o uso de um gradiente coloide de sílica em vez de um gradiente de sacarose é recomendado para uma remoção mais eficiente da mielina. Verificamos também que o uso de um rotor de caçamba oscilante no final da etapa de centrifugação do gradiente sacarose/sílica coloide minimiza a perda de núcleos. Por isso, o uso de tal rotor é altamente recomendado. Quarto, após testar múltiplos métodos de contagem de núcleos (contagem manual ao microscópio, uso de vários contadores automatizados), recomenda-se o uso de um contador automático de células fluorescentes22. O uso de um corante intercalante de DNA, como o iodeto de propídio, aumenta a precisão da contagem de núcleos. Em quinto lugar, este protocolo leva cerca de 75 minutos desde o início até o carregamento do chip microfluídico. Isso ajuda a garantir que a integridade dos núcleos permaneça alta ao processar várias amostras. Finalmente, descobrimos que o protocolo também é compatível com o tecido composto de temperatura de corte ideal (OCT). Se usar esse material, o tecido pode ser removido do bloco OCT usando um bisturi antes da homogeneização.
Um desafio frequente em conjuntos de dados de sequenciamento de RNA de núcleo único é a presença de RNA ambiente, que pode ser não nuclear (por exemplo, mitocondrial), bem como derivado nuclear27,28. Em nosso protocolo, o RNA mitocondrial (um proxy para o RNA ambiente não nuclear) é baixo mesmo antes da filtragem (0,1-1,6% para os tecidos mostrados). No entanto, à semelhança de outros protocolos e conjuntos de dados, a contaminação por RNA ambiente a partir de genes altamente expressos nos núcleos de tipos celulares abundantes (como hepatócitos no fígado, neurônios no cérebro, etc.) ainda está presente27. Existem várias ferramentas de bioinformática, como CellBender, SoupX, etc., que podem remover essa contaminação do RNA ambiente antes da anotação dosnúcleos 29,30,31. Outra limitação desse protocolo é que, embora as etapas de ruptura tecidual e isolamento de núcleos sejam automatizadas, o rendimento dessa etapa ainda é limitado, pois apenas uma amostra pode ser processada por vez. No entanto, como essa etapa leva apenas aproximadamente 7 min por pedaço de tecido, várias amostras ainda podem ser processadas em um lote. Normalmente, processamos quatro amostras por lote, mas fizemos até seis amostras por lote com bons resultados. Melhorias recentes no dissociador robótico para permitir o processamento paralelo de duas amostras simultaneamente permitirão o processamento de 8-12 amostras por lote, o que é compatível com o rendimento do chip microfluídico que é usado para encapsulamento de núcleos únicos.
Embora não tenhamos utilizado os núcleos isolados por este protocolo para outras aplicações a jusante como ATAC-seq ou snRNAseq utilizando outras plataformas, com base na qualidade dos dados obtidos com os reagentes de expressão gênica aqui utilizados, acreditamos que nosso protocolo deva ser compatível com aplicações adicionais a jusante. No entanto, trabalhos futuros envolverão o teste desse protocolo com outras aplicações downstream, como ATAC-seq.
Em conclusão, desenvolvemos um protocolo de isolamento de núcleos rápido, simples e parcialmente automatizado para sequenciamento de RNA de núcleo único a jusante que demonstrou ser compatível com diferentes tipos de tecidos congelados de mamíferos.

O sequenciamento de RNA de célula única (sc) e núcleo único (sn) tornou-se um protocolo comumente utilizado em biologia molecular e celular devido à maior resolução da expressão gênica em comparação com o sequenciamento de RNA em massa. No entanto, o isolamento de preparações de células únicas e núcleos únicos de boa qualidade a partir de tecidos sólidos permanece um desafio e é frequentemente a etapa limitante da taxa em experimentos de sc/sn-RNAseq. De fato, uma infinidade de protocolos tem sido desenvolvida utilizando diversos procedimentos químicos e mecânicos para a obtenção de suspensões células/núcleos1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,13,14,15 . Além disso, as estratégias para limpar essas preparações de detritos/aglomerados, etc., vão desde a classificação do fluxo até a filtragem e lavagem. Tais protocolos são frequentemente manuais (levando à variabilidade relacionada ao usuário), podem ser demorados (levando à redução da viabilidade celular/núcleo) e/ou podem exigir acesso a um citômetro de fluxo para a classificação célula/núcleo. Este estudo concentrou-se no desenvolvimento de um protocolo simples, rápido e parcialmente automatizado de isolamento de núcleos únicos a partir de tecidos congelados de mamíferos para aplicações de sequenciamento de RNA a jusante. Nós nos concentramos especificamente no isolamento de núcleos em oposição ao isolamento celular, pois é compatível com o uso de tecidos congelados, tornando a coleta/processamento de amostras mais prática e permitindo o lote imparcial de amostras, especialmente em experimentos de curso de tempo. Além disso, embora o transcriptoma nuclear não reflita completamente o transcriptoma celular, vários estudos já mostraram que os dados de sequenciamento de RNA de núcleo único são comparáveis aos dados de sequenciamento de RNA de célula única para identificação de tipo celular, embora as proporções de tipos celulares possam variar6,16,17,18,19.
O isolamento dos núcleos consiste em várias etapas: 1) ruptura mecânica ou química do tecido para liberar os núcleos, 2) limpeza de detritos e aglomerados e 3) contagem precisa dos núcleos para preparação para aplicações a jusante. Em vários protocolos, o passo 1 frequentemente envolve o uso de homogeneizador Dounce para romper o tecido 3,20. Alternativamente, métodos químicos podem ser utilizados, embora estes frequentemente precisem ser otimizados para diferentes tecidos 2,5,6. Experimentamos que um procedimento manual de ruptura tecidual é propenso à variabilidade associada ao operador, levando a qualidade e rendimento variáveis dos núcleos. Com o objetivo de minimizar a variabilidade técnica e ter um protocolo mais consistente e reprodutível que funcione entre os tecidos, foi desenvolvido um protocolo que utiliza um dissociador tecidual robótico disponível comercialmente21. Para a etapa 2, embora a troca tampão seja geralmente o meio mais simples para a lavagem dos núcleos, adotamos o uso de uma etapa relativamente curta de centrifugação por gradiente de sacarose para uma remoção mais completa dos debris. Para o tecido cerebral especificamente, usamos um gradiente coloide de sílica em vez de um gradiente de sacarose para uma remoção mais eficaz da mielina. Finalmente, para a contagem, o uso de um hemocitômetro é o padrão-ouro para contagem e inspeção visual dos núcleos. Em nosso protocolo, essa etapa pode ser automatizada de forma confiável usando um contador automatizado de células fluorescentes disponível comercialmente22. Este protocolo foi testado e é compatível com vários tecidos congelados de mamíferos, incluindo cérebro, rim, baço e fígado, de diferentes espécies de mamíferos (rato, camundongo e primata não humano) e fornece núcleos de boa qualidade para sequenciamento de RNA de núcleos únicos a jusante com uma plataforma comercial baseada em gotículas. O protocolo leva aproximadamente 75 min desde a preparação do tecido até o início do fluxo de sequenciamento de RNA de núcleos únicos.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1 M DTT</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>P2325</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10% Tween 20</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1662404</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10x Magnetic Separator</td>
			<td>10x genomics</td>
			<td>PN-120250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10x Vortex Adapter</td>
			<td>10x genomics</td>
			<td>PN-120251</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1x DPBS (10x), no calcium, no magnesium</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>14190144</td>
			<td>stored at 4&#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>30% Bovine Serum Albumin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A9576_50ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>400 mM Tris-HCl, pH 8.0</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15568025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>40U/&#956;l RNaseOUT Recombinant Ribonuclease Inhibitor</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>10777019</td>
			<td>Stored at -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agilent High Sensitivity DNA Kit</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>5067-4626</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cellaca MX High-throughput Automated Cell Counter</td>
			<td>Nexcelom Bioscience</td>
			<td>CELMXSYSF2</td>
			<td>Automated fluorescent cell counter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chromium Next GEM Chip G Single Cell Kit, 16 rxns</td>
			<td>10x genomics</td>
			<td>PN-1000127</td>
			<td>Single cell gene expression reagent, stored at room temperature</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chromium Next GEM Secondary Holder</td>
			<td>10x genomics</td>
			<td>PN-1000195</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chromium Next GEM Single Cell 3&#39; Gel Bead Kit v3.1, 4 rxns</td>
			<td>10x genomics</td>
			<td>PN-1000129</td>
			<td>Single cell gene expression reagent, stored at -80 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chromium Next GEM Single Cell 3&#39; GEM, Library &#38; Gel Bead Kit v3.1, 4 rxns</td>
			<td>10x genomics</td>
			<td>PN-1000128</td>
			<td>Single cell gene expression reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chromium Next GEM Single Cell 3&#39; Library Kit v3.1 4 rxns</td>
			<td>10x genomics</td>
			<td>PN-1000158</td>
			<td>Single cell gene expression reagent, stored at -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chromium Next GEM Single Cell 3&#39;GEM Kit v3.1 4 rxns</td>
			<td>10x genomics</td>
			<td>PN-1000130</td>
			<td>Single cell gene expression reagent, stored at -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Divided Polystyrene Reservoirs</td>
			<td>VWR</td>
			<td>41428-958</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNA LoBind Tubes 1.5ml Eppendorf</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>EP0030108051</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNA LoBind Tubes 2ml Eppendorf</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>EP0030108078</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dry ice</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dynabeads MyOne SILANE</td>
			<td>10x genomics</td>
			<td>PN-2000048</td>
			<td>Single cell gene expression reagent, stored at 4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol Pure</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>E7023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerin (Glycerol), 50% (v/v)</td>
			<td>Ricca Chemical Company</td>
			<td>3290-16</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heatblock</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High-Throughput Nexcelom Counting Plates</td>
			<td>Nexcelom Bioscience</td>
			<td>CHM24-A100-001</td>
			<td>Cell counter counting plate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Low TE Buffer (10 mM Tris-HCl pH 8.0, 0.1 mM EDTA)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>12090015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mini Centrifuge</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NovaSeq 6000 SP Reagent Kit v1.5 (100 cycles)</td>
			<td>Illumina</td>
			<td>2002840</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nuclei Isolation Buffer</td>
			<td>S2 Genomics</td>
			<td>100-063-396</td>
			<td>Stored at 4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nuclei Isolation Cartridge</td>
			<td>S2 Genomics</td>
			<td>100-063-287</td>
			<td>Precooled at 4 &#176;C before use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nuclei PURE 2 M Sucrose Cushion Solution</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>NUC201-1KT</td>
			<td>Sucrose cushion solution&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nuclei PURE Sucrose Cushion Buffer</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>NUC201-1KT</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nuclei Storage Reagent</td>
			<td>S2 Genomics</td>
			<td>100-063-405</td>
			<td>Stored at 4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PCR Tubes 0.2 ml 8-tube strips</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>30124359</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Percoll</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>17-0891-02</td>
			<td>Silica colloid solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PhiX Control v3</td>
			<td>Illumina</td>
			<td>FC-110-3001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qiagen Buffer EB</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>19086</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qubit dsDNA HS Assay Kit</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>Q32854</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Refrigerated Centrifuge (Eppendorf 5804R)</td>
			<td>Eppendorf&#160;</td>
			<td>5805000010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Refrigerated Centrifuge with Swinging-Bucket Rotor (Eppendorf 5810R)</td>
			<td>Eppendorf&#160;</td>
			<td>5811000015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNAseZap</td>
			<td>Ambion</td>
			<td>AM9780</td>
			<td>RNAse decontamination solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Round cell culture petri dish</td>
			<td>SPL</td>
			<td>330005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scalpel disposable</td>
			<td>Aesculap AG</td>
			<td>BA210</td>
			<td>pre-cooled on dry ice before use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Single Index Kit T Set A, 96 rxns</td>
			<td>10x genomics</td>
			<td>PN-1000213</td>
			<td>Single cell gene expression reagent, stored at -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Singulator 100 System</td>
			<td>S2 Genomics</td>
			<td>-</td>
			<td>Commercially available robotic tissue dissociator</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Hydroxide 1M</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>72068</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SPRIselect Reagent Kit</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>b23318</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile tweezers</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UltraPure DNase/RNase-Free Distilled Water</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>10977049</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ViaStain PI Staining Solution</td>
			<td>Nexcelom Bioscience</td>
			<td>CS1-0109-5mL</td>
			<td>Propidium iodide staining solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vortex Mixer+A2:D44</td>
			<td>VWR</td>
			<td>-</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a simple, quick, and partially automated protocol for the isolation of single nuclei from frozen mammalian tissues for single nucleus sequencing

O sequenciamento de RNA de célula única e de núcleo único tornou-se aplicações laboratoriais comuns devido à riqueza de informações transcriptômicas que fornecem. O sequenciamento de RNA de núcleo único, particularmente, é útil para investigar a expressão gênica em tecidos de difícil dissociação. Além disso, essa abordagem também é compatível com material congelado (arquivamento). Aqui, descrevemos um protocolo para isolar núcleos únicos de alta qualidade de tecidos congelados de mamíferos para sequenciamento de RNA de núcleo único a jusante de forma parcialmente automatizada usando instrumentos e reagentes disponíveis comercialmente. Especificamente, um dissociador robótico é usado para automatizar e padronizar a homogeneização do tecido, seguido por um gradiente químico otimizado para filtrar os núcleos. Por fim, contamos os núcleos de forma precisa e automática usando um contador automatizado de células fluorescentes. O desempenho deste protocolo é demonstrado no cérebro de camundongos, rins de ratos e tecido hepático e baço de cynomolgus. Este protocolo é simples, rápido e facilmente adaptável a vários tecidos de mamíferos sem a necessidade de otimização extensiva e fornece núcleos de boa qualidade para sequenciamento de RNA de núcleos únicos a jusante.

Single-cell (sc) and single-nucleus (sn) RNA sequencing have become commonly used protocols in molecular and cellular biology due to the increased resolution of gene expression compared to bulk RNA sequencing. However, the isolation of good quality single cell and single nuclei preparations from solid tissues remains a challenge and is often the rate-limiting step in sc/sn-RNAseq experiments. Indeed, a plethora of protocols has been developed that use various chemical and mechanical procedures to obtain cell/nuclei suspensions1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,13,14,15. Furthermore, strategies to clean up such preparations from debris/clumps, etc., range from flow sorting to filtration to washing. Such protocols are often manual (leading to user-related variability), can be time-consuming (leading to reduced cell/nucleus viability), and/or may require access to a flow cytometer for cell/nucleus sorting. This&#160;study focused on developing a simple, quick, and partially automated single nuclei isolation protocol from frozen mammalian tissues for downstream RNA sequencing applications. We focused specifically on nuclei isolation as opposed to cell isolation as it is compatible with the use of frozen tissues, rendering sample collection/processing more practical and enabling unbiased batching of samples, especially in time-course experiments. Furthermore, although the nuclear transcriptome does not fully reflect the cellular transcriptome, several studies have now shown that single nuclei RNA sequencing data is comparable to single cell RNA sequencing data for cell-type identification, even though the proportions of cell types can vary6,16,17,18,19.
Nuclei isolation consists of several steps: 1) mechanical or chemical disruption of the tissue to release the nuclei, 2) clean-up of debris and clumps, and 3) accurate counting of nuclei for preparation for downstream applications. In a number of protocols, step 1 frequently involves the use of a Dounce homogenizer in order to disrupt the tissue3,20. Alternatively, chemical methods can be used, although these often need to be optimized for different tissues2,5,6. We have experienced that a manual tissue disruption procedure is prone to operator-associated variability, leading to variable quality and yield of nuclei. In order to minimize technical variability and to have a more consistent and reproducible protocol that works across tissues, a protocol that uses a commercially available robotic tissue dissociator was developed21. For step 2, although buffer exchange is usually the simplest means for washing nuclei, we adopted the use of a relatively short sucrose gradient centrifugation step to have a more thorough removal of debris. For brain tissue specifically, we use a silica colloid gradient instead of a sucrose gradient&#160;for more effective myelin removal. Finally, for counting, the use of a hemocytometer is the gold standard for counting and visually inspecting the nuclei. In our protocol, this step can be reliably automated using a commercially available automated fluorescent cell counter22. This protocol has been tested and is compatible with several frozen mammalian tissues, including brain, kidney, spleen, and liver, from different mammalian species (rat, mouse, and non-human primate) and provides good quality nuclei for downstream single nuclei RNA sequencing with a droplet-based commercial platform. The protocol takes approximately 75 min from tissue preparation to the start of the single nuclei RNA sequencing workflow.

Autor em destaque: Aprimorando a descoberta de medicamentos - Desenvolvimento de protocolos automatizados e padronizados para extração de núcleos de tecidos congelados 

Um Protocolo Simples, Rápido e Parcialmente Automatizado para o Isolamento de Núcleos Únicos de Tecidos Congelados de Mamíferos para Sequenciamento de Núcleo Único

This research focuses on supporting drug discovery studies using single nuclei RNA sequencing to investigate the efficacy and safety of potential treatments. Therefore, we are developing standardized nuclei extraction protocols for fresh frozen tissue samples from various organs. Our goal was to automate and standardize nuclei extraction to achieve consistent and reliable results by reducing non-biological variability.The advantage is the partial automation through the use of a robotic dissociator and the simple and short workflow that can be applied on various tissue samples of different species. Having standardized protocols can help us answer questions about drug biodistribution, as well as explore the mechanisms underlying any safety signals that we might observe. In the future, we will be testing the applicability of our protocol for other downstream applications, such as ATAC-seq or multiomics.We will also try to establish protocols to detect virally expressed transgenes in single nuclei.

O desempenho e a versatilidade deste protocolo são demonstrados pela realização de sequenciamento de RNA de núcleo único em tecido fresco congelado do córtex occipital cerebral de três camundongos B6, tecido renal fresco congelado transversalmente cortado de três ratos Wistar, fígado de arquivo (11 anos de idade) e tecido esplênico de três macacos Cynomolgus Maurícios. Todos os animais não foram perfundidos.
Como mostrado nas Figuras 1B,C, foram obtidos núcleos de boa qualidade e livres de sinais de blebbing, debris e aglomeração. A filtração baseada em gradiente de sacarose foi otimizada para remover a maioria dos detritos, testando diferentes densidades, velocidades de rotação e tempos, e avaliando a pureza/integridade nuclear em um microscópio, bem como avaliando a distribuição do tamanho dos núcleos e o rendimento (Figura 1D). Isso nos permitiu escolher uma densidade de gradiente de sacarose de 1,5 M e usar um curto tempo de rotação de 15 min. Em seguida, para avaliar melhor a qualidade dos núcleos, os dados foram pré-processados usando 10X Cell Ranger, e uma análise posterior dos dados a jusante foi realizada usando Besca23. Núcleos com >5% de conteúdo mitocondrial (pois estes tendem a ser núcleos danificados/estressados) foram filtrados, e núcleos com 500-7.000 genes (para minimizar gotículas e multipletos vazios) foram retidos. Foram incluídos apenas genes presentes em pelo menos 30 núcleos. Visamos 8.000 núcleos por amostra de córtex cerebral e 10.000 núcleos por amostra de rim, fígado e baço. Após filtração, 10.644 núcleos de alta qualidade das três amostras de cérebro, 14.960 núcleos de alta qualidade das três amostras de rim, 18.795 núcleos de alta qualidade das três amostras de fígado e 13.882 núcleos de alta qualidade das três amostras de baço foram obtidos. A Figura 2A,D,G,J mostra gráficos de violino representando a distribuição das contagens de UMI, contagens gênicas e conteúdo mitocondrial em cada amostra. O número mediano de contagens em todas as amostras de cérebro foi de 7.563 UMI/núcleo e 3.208 genes/núcleo. O número mediano de contagens em todas as amostras de rim foi de 3.841 UMI/núcleo e 1.915 genes/núcleo. O número mediano de contagens em todas as amostras de fígado foi de 2.649 UMI/núcleos e 1.676 genes/núcleos. O número mediano de contagens em todas as amostras de baço foi de 1.609 UMI/núcleos e 1.138 genes/núcleos. Em seguida, geramos clusters usando genes altamente variáveis e os anotamos usando genes marcadores conhecidos 17,24,25,26. Como visto na Figura 2B,E,H,K, conseguimos identificar os tipos celulares esperados de cada tecido. Além disso, como visto na Figura 2B,E,H,K, todos os animais contribuíram para todos os agrupamentos, indicando baixa variabilidade técnica geral introduzida pelo protocolo. Além disso, as proporções celulares foram comparáveis nas três amostras por tipo de tecido, assim como a UMI e a contagem gênica (Figura 2A,C,D,F,G,I,J,L). Uma exceção notável é o fígado, onde as populações de hepatócitos entre as três amostras de fígado foram diferentes em proporções e perfil. Isto é provavelmente devido a diferenças biológicas entre os animais (sexo, idade, estado metabólico).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65611/65611fig01.jpg"> Figura 1: Avaliação da qualidade dos núcleos e otimização do gradiente de sacarose . (A) A separação de fase esperada durante a centrifugação do gradiente de sacarose é mostrada com uma seta. (B) Imagens fluorescentes representativas dos núcleos do rim de rato corados com iodeto de propídio (parte superior) e do baço de cynomolgus (abaixo) obtidas com o protocolo. (C) Imagens representativas de microscopia de campo claro de núcleos isolados de fígado de camundongo (superior) e cérebro de camundongo (inferior), barra de escala de 500 μm. Observe a superfície lisa regular dos núcleos indicando boa qualidade nuclear. (D) Otimização do gradiente de sacarose. Várias densidades de sacarose, velocidades de rotação e tempos de rotação foram testados. Imagens de microscopia de campo claro dos núcleos, distribuição do tamanho dos núcleos e rendimento dos núcleos são mostradas para cada condição. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65611/65611fig01large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65611/65611fig02.jpg"> Figura 2: Dados representativos do snRNAseq no córtex occipital do cérebro de camundongos, rim de rato (córtex e medula) e fígado e baço de macaco cynomolgus. (A) Gráficos de violino mostrando a distribuição de genes/núcleo, UMIs/núcleo e porcentagem de conteúdo mitocondrial por amostra de cérebro. (B) Painel esquerdo: gráfico UMAP mostrando a contribuição de cada amostra para os conglomerados identificados no cérebro. Painel direito: UMAP mostrando as identidades dos agrupamentos anotados com base em genes marcadores no tecido cerebral. (C) Proporções celulares observadas nas 3 amostras de cérebro. (D) Gráficos de violino mostrando a distribuição de genes/núcleo, UMIs/núcleo e porcentagem de conteúdo mitocondrial por amostra de rim. (E) Painel esquerdo: gráfico UMAP mostrando a contribuição de cada amostra para os conglomerados identificados no rim. Painel direito: UMAP mostrando as identidades dos agrupamentos anotados com base em genes marcadores no tecido renal. (F) Proporções celulares observadas nas 3 amostras de rim. (G) Gráficos de violino mostrando a distribuição de genes/núcleo, UMIs/núcleo e porcentagem de conteúdo mitocondrial por amostra de fígado. (H) Painel esquerdo: gráfico UMAP mostrando a contribuição de cada amostra para os conglomerados identificados no fígado. Painel direito: UMAP mostrando as identidades dos agrupamentos anotados com base em genes marcadores no tecido hepático. (I) Proporções celulares observadas nas 3 amostras de fígado. (J) Gráficos de violino mostrando a distribuição de genes/núcleo, UMIs/núcleo e porcentagem de conteúdo mitocondrial por amostra de baço. (K) Painel esquerdo: gráfico UMAP mostrando a contribuição de cada amostra para os conglomerados identificados no baço. Painel direito: UMAP mostrando as identidades dos clusters anotados com base em genes marcadores no tecido do baço. (L) Proporções celulares observadas nas 3 amostras de baço. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65611/65611fig02large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td>Componentes</td>
			<td>Concentração de estoques</td>
			<td>Volume por amostra</td>
			<td>Concentração Final</td>
		</tr><tr><td>Solução de almofada de sacarose</td>
			<td>2 milh</td>
			<td>1500 μL</td>
			<td>1.5 milh</td>
		</tr><tr><td>Tampão de almofada de sacarose</td>
			<td>-</td>
			<td>500 μL</td>
			<td>-</td>
		</tr><tr><td>Ditiotreitol (TDT)</td>
			<td>1 milh</td>
			<td>2 μL</td>
			<td>1 mM</td>
		</tr><tr><td>Inibidor de RNAse</td>
			<td>40 U/μL</td>
			<td>10 μL</td>
			<td>0,2 U/μL</td>
		</tr></tbody></table>Tabela 1: Preparação de solução de almofada de sacarose 1,5 M (SCS). Esta solução é utilizada para a centrifugação do gradiente de sacarose durante a limpeza na etapa 3.1 e deve ser preparada na hora de cada vez antes de iniciar o protocolo. Mantenha sempre o SCS no gelo durante o protocolo. As soluções mencionadas nesta tabela são referenciadas na Tabela de Materiais.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td>Componentes</td>
			<td>Concentração de estoques</td>
			<td>Volume por amostra</td>
			<td>Concentração Final</td>
		</tr><tr><td>Solução-mãe de coloide de sílica</td>
			<td>90%</td>
			<td>600 μL</td>
			<td>18%</td>
		</tr><tr><td>Reagente de Armazenamento de Núcleos (Genômica S2)</td>
			<td>-</td>
			<td>2400 μL</td>
			<td>-</td>
		</tr><tr><td>Inibidor de RNAse</td>
			<td>40 U/μL</td>
			<td>15 μL</td>
			<td>0,2 U/μL</td>
		</tr></tbody></table>Tabela 2: Preparação da solução coloide de sílica a 18%. Esta solução é utilizada para a centrifugação do gradiente coloide de sílica durante a limpeza na etapa 3.2 e deve ser preparada na hora de cada vez antes de iniciar o protocolo. Manter sempre a solução coloide de sílica a 18% congelada durante o protocolo.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td>Tecido</td>
			<td>Peso da amostra</td>
			<td>Cartucho</td>
			<td>Rendimento</td>
		</tr><tr><td>Fígado de rato</td>
			<td>magnésio 25</td>
			<td>Cartucho de isolamento de núcleos</td>
			<td>65.000 núcleos por mg de tecido</td>
		</tr><tr><td>Fígado de rato</td>
			<td>magnésio 4</td>
			<td>Cartucho de isolamento de núcleos de entrada pequeno</td>
			<td>32.000 núcleos por mg de tecido</td>
		</tr></tbody></table>Tabela 3: Rendimento de núcleos do cartucho de isolamento de núcleos de baixa entrada versus o cartucho de isolamento de núcleos após a limpeza do gradiente de sacarose.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td>Componentes</td>
			<td>Concentração de estoques</td>
			<td>Volume por amostra</td>
			<td>Concentração Final</td>
		</tr><tr><td>Reagente de Armazenamento de Núcleos</td>
			<td>-</td>
			<td>1000 μL</td>
			<td>-</td>
		</tr><tr><td>Inibidor de RNAse</td>
			<td>40 U/μL</td>
			<td>5 μL</td>
			<td>0,2 U/μL</td>
		</tr></tbody></table>Tabela 4: Preparação do reagente de armazenamento de núcleos (NSR). Esta solução é utilizada durante o isolamento de núcleos nos passos 3-5, bem como durante a limpeza no passo 3.1.8. Pode ser armazenado a 4 °C por até 4 meses. Prepare uma alíquota fresca com inibidor de RNase durante a etapa de centrifugação na etapa de limpeza 6. As soluções mencionadas nesta tabela são referenciadas na Tabela de Materiais.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td colspan="4">1x PBS + 0,04% BSA solução de estoque</td>
		</tr><tr><td>Componentes</td>
			<td>Concentração de Estoques</td>
			<td>Volume para estoque</td>
			<td>Concentração Final</td>
		</tr><tr><td>PBS (sem Ca 2+, sem Mg2+)</td>
			<td>1x</td>
			<td>30 mL</td>
			<td>-</td>
		</tr><tr><td>Albumina de Soro Bovino (BSA)</td>
			<td>30%</td>
			<td>40 μL</td>
			<td>0.04%</td>
		</tr><tr><td colspan="4">1x PBS + 0,04% BSA + 0,2 U/μL inibidor de RNAse</td>
		</tr><tr><td>Componentes</td>
			<td>Concentração de Estoques</td>
			<td>Volume por amostra</td>
			<td>Concentração Final</td>
		</tr><tr><td>1x PBS + 0,04% BSA Solução de Estoque</td>
			<td>-</td>
			<td>500 μL</td>
			<td>-</td>
		</tr><tr><td>Inibidor de RNAse</td>
			<td>40 U/μL</td>
			<td>2,5 μL</td>
			<td>0,2 U/μL</td>
		</tr></tbody></table>Tabela 5: Preparo do PBS + BSA 0,04%. Esta solução é utilizada no final da limpeza na etapa 3.1.10 e após contagem para diluir a suspensão dos núcleos até a concentração desejada para a sequenciação de RNA de núcleo único 10X (etapa de contagem 4.4). A solução-mãe pode ser armazenada a 4 °C por até 1 mês. Prepare uma alíquota fresca com inibidor de RNase durante a etapa de centrifugação na etapa de limpeza 6.

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O estudo descreve um protocolo simples, rápido e parcialmente automatizado para isolar núcleos de alta qualidade de tecidos congelados de mamíferos para sequenciamento de RNA de núcleo único a jusante.

Single-cell and single-nucleus RNA sequencing have become common laboratory applications due to the wealth of transcriptomic information that they ...

Esta pesquisa se concentra em apoiar estudos de descoberta de drogas usando o sequenciamento de RNA de núcleo único para investigar a eficácia e a segurança de tratamentos potenciais. Portanto, estamos desenvolvendo protocolos padronizados de extração de núcleos para amostras de tecido fresco congelado de vários órgãos. Nosso objetivo era automatizar e padronizar a extração de núcleos para alcançar resultados consistentes e confiáveis, reduzindo a variabilidade não biológica.A vantagem é a automação parcial através do uso de um dissociador robótico e o fluxo de trabalho simples e curto que pode ser aplicado em várias amostras de tecidos de diferentes espécies. Ter protocolos padronizados pode nos ajudar a responder a perguntas sobre a biodistribuição de medicamentos, bem como explorar os mecanismos subjacentes a quaisquer sinais de segurança que possamos observar. No futuro, testaremos a aplicabilidade do nosso protocolo para outras aplicações downstream, como ATAC-seq ou multiômica.Também tentaremos estabelecer protocolos para detectar transgenes expressos viricamente em núcleos únicos.

a-simple-quick-partially-automated-protocol-for-isolation-single

Research

JoVE Journal

Biology

A Simple, Quick, and Partially Automated Protocol for the Isolation of Single Nuclei from Frozen Mammalian Tissues for Single Nucleus Sequencing

2.8K visualizações.  Roche Innovation Centre Basel. Esta pesquisa se concentra em apoiar estudos de descoberta de drogas usando o sequenciamento de RNA de núcleo único para investigar a eficácia e a segurança de tratamentos potenciais. Portanto, estamos desenvolvendo protocolos padronizados de extração de núcleos para amostras de tecido fresco congelado de vários órgãos. Nosso objetivo era automatizar e padronizar a extração de núcleos para alcançar resultados consistentes e confiáveis, reduzindo a variabilidade não biológica....

Vídeo: Autor em destaque: Aprimorando a descoberta de medicamentos - Desenvolvimento de protocolos automatizados e padronizados para extração de núcleos de tecidos congelados 

Single-cell and single-nucleus RNA sequencing have become common laboratory applications due to the wealth of transcriptomic information that they provide. Single nucleus RNA sequencing, particularly, is useful for investigating gene expression in difficult-to-dissociate tissues. Furthermore, this approach is also compatible with frozen (archival) material. Here, we describe a protocol to isolate high-quality single nuclei from frozen mammalian tissues for downstream single nucleus RNA sequencing in a partially-automated manner using commercially available instruments and reagents. Specifically, a robotic dissociator is used to automate and standardize tissue homogenization, followed by an optimized chemical gradient to filter the nuclei. Lastly, we accurately and automatically count the nuclei using an automated fluorescent cell counter. The performance of this protocol is demonstrated on mouse brain, rat kidney, and cynomolgus liver and spleen tissue. This protocol is straightforward, rapid, and readily adaptable to various mammalian tissues without requiring extensive optimization and provides good quality nuclei for downstream single nuclei RNA sequencing.

The study describes a simple, quick, and partially automated protocol to isolate high-quality nuclei from frozen mammalian tissues for downstream single nuclei RNA sequencing.

Biologia

Isolation of Single Nuclei from Frozen Mammalian Tissues for Single Nuclei RNA Sequencing

To begin, start the robotic dissociator. Turn on the cooling by setting the slider at the top of the right of the screen to Cool, and clicking on it to start cooling so that the slider appears orange. Next, check that the attached NSR and NIB bottles have sufficient liquid and are properly cooled.Remove the tissue samples from the minus 80 degrees Celsius freezer, and immediately place them on dry ice. Using a pre-cooled scalpel, cut the tissue into a 15 to 50 milligram piece on a pre-cooled Petri dish, or metal plate, placed on dry ice. Remove the nuclei isolation cartridge from the refrigerator and unpack it.Remove the grinder, and pipette 15 microliters of RNAs inhibitor to the bottom of the cartridge. Using tweezers, place the tissue sample at the bottom of the cartridge. Next, select Run a Protocol on the instrument, and click on the Nuclei option in the upper left corner.From the menu, select the Low Volume Nuclei isolation protocol, and then click on Modify to verify that the disruption speed is set to fastest. Then, open the instrument door. Insert the cartridge into the designated location.Rotate the cartridge lock, and slide into the stage until the red knob clicks into place. Close the door and click Next to start the nuclei extraction run. Once the run is finished, remove the cartridge from the instrument by lifting the red knob and pulling out the stage.Immediately place the cartridge on ice.

Isolamento de Núcleos Únicos de Tecidos Congelados de Mamíferos para Sequenciamento de RNA de Núcleos Únicos

Clean-Up and Counting of Isolated Single Nuclei from Frozen Mammalian Tissues

After isolating single nuclei from frozen mammalian tissues, carefully pierce the round foil on the dissociator cartridge using a pipette tip. To facilitate sucrose gradient cleanup, remove 900 microliters of the nuclei suspension from the cartridge and add it to 500 microliters of sucrose cushion solution or SCS prepared in a two milliliter tube. Mix well by pipetting until the mixture is homogenous.Next, hold the tube at an angle, and carefully add 1, 400 microliters of nuclei suspension SCS mixture drop-wise onto a new 500 microliters of SCS, creating a clearly visible phase separation. Carefully close the tube, and place it back on the ice without disturbing the phase separation. Carefully spin the tubes at 13, 000g for 15 minutes at four degrees Celsius in a pre-cooled centrifuge.Remove the supernatant without disturbing the palette, and carefully resuspend the palette in 50 microliters of ice-cold NSR. Pull the two palettes of the same sample in a new 1.5 milliliter tube. Add 900 microliters of ice-cold NSR to a total volume of one milliliter, and mix well by pipetting.Centrifuge the sample at 500g for five minutes at four degrees Celsius with a swinging bucket rotor centrifuge. Remove the supernatant and resuspend the pellet in 100 microliters of PBS. For counting, dilute 10 microliters of nuclei suspension in 20 microliters of PBS.Add 25 microliters of propidium iodide staining solution to a mixing well of the fluorescent counter counting plate. Then add 25 microliters of diluted nuclei suspension, and mix well by pipetting. Transfer 50 microliters of the stained sample from the mixing well to the loading well.Load the counting plate on the cell counter and start the count. After counting, dilute the samples with PBS to the desired concentration for single nuclei RNA sequencing. Using the partially automated nuclei isolation protocol, good quality nuclei were obtained without signs of blabbing, debris or clumping.Violin plots representing the distribution of gene counts, UMI counts and mitochondrial content in each sample are shown. Expected cell types from each tissue were identified, and all animals contributed to all clusters, indicating low technical variability introduced by the protocol. Furthermore, cellular proportions, UMI counts and gene counts were comparable across all three samples per tissue type.